Phát triển kỹ thuật Multiplex Real-time PCR phát hiện đồng thời bốn gen kháng colistin từ mcr-1 đến mcr-4

Bài viết trình bày việc thiết kế các bộ primer/probe đặc hiệu để có thể phát hiện đồng thời 4 gen kháng colistin từ mcr-1 đến mcr-4 bằng kỹ thuật Multiplex Realtime PCR. Các trình tự DNA của các gen từ mcr-1 đến mcr-4 được phân tích bằng các phần mềm tin sinh học (Clustal Omega, BioEdit, Fast PCR) để thiết kế 4 bộ primer/probe đặc hiệu cho các gen tương ứng.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Phát triển kỹ thuật Multiplex Real-time PCR phát hiện đồng thời bốn gen kháng colistin từ mcr-1 đến mcr-4 TẠP CHÍ Y DƯỢC THÁI BÌNH, TẬP 12 SỐ 3 - THÁNG 9 NĂM 2024 PHÁT TRIỂN KỸ THUẬT MULTIPLEX REAL-TIME PCR PHÁT HIỆN ĐỒNG THỜI BỐN GEN KHÁNG COLISTIN TỪ mcr-1 ĐẾN mcr-4 Nguyễn Nam Thắng1*, Lê Việt Hà1, Trần Thị Hòa1, Nguyễn Thị Hoa1, TÓM TẮT Nguyễn Xuân Bái1, Khổng Thị Điệp1 Mục tiêu: Thiết kế các bộ primer/probe đặc hiệu ABSTRACTđể có thể phát hiện đồng thời 4 gen kháng colistin Objective: To design specific primer/probe setstừ mcr-1 đến mcr-4 bằng kỹ thuật Multiplex Real- to simultaneously detect 4 colistin resistancetime PCR. genes from mcr-1 to mcr-4 using a Multiplex Real- Phương pháp: Các trình tự DNA của các gen time PCR assay.từ mcr-1 đến mcr-4 được phân tích bằng các phần Method: The DNA sequences of genes frommềm tin sinh học (Clustal Omega, BioEdit, Fast mcr-1 to mcr-4 were analyzed using bioinformaticPCR) để thiết kế 4 bộ primer/probe đặc hiệu cho software (Clustal Omega, BioEdit, Fast PCR)các gen tương ứng. Sau khi tối ưu hóa về nồng độ to design 4 specific primer/probe sets for theprimer/probe, nồng độ MgCl2 và xác định giới hạn corresponding genes. After optimizing the primer/phát hiện của kỹ thuật Multiplex Real-time PCR, probe concentration, MgCl2 concentration, andchúng tôi đánh giá về độ nhạy và độ đặc hiệu của determining the detection limit of the Multiplexkỹ thuật bằng cách so sánh với kỹ thuật Multiplex Real-time PCR assay, we evaluate the sensitivityPCR do Yamaguchi và cộng sự đề xuất [3]. and specificity of the assay by comparing it with Kết quả: Kỹ thuật Multiplex Real-time PCR có the Multiplex PCR method proposed by Yamaguchiđộ ổn định rất cao, sự thay đổi về nồng độ primer/ and colleagues [3].probe từ 0,2/0,08 đến 0,6/0,24 µM hay sự thay Results: The Multiplex Real-time PCR assayđổi về nồng độ MgCl2 từ 3,0 đến 5,0 mM hầu như had very high stability, the change in primer/probekhông ảnh hưởng tới kết quả của phản ứng. Khi concentration from 0.2/0.08 to 0.6/0.24 µM or thethử nghiệm với các mẫu chứng dương có nồng độ change in MgCl2 concentration from 3.0 to 5.0 mMtừ 100 đến 108 bản sao/phản ứng, kỹ thuật có thể hardly affected the test results. When testing withphát hiện khi trong mẫu có từ 101 bản sao/phản positive control samples with concentrations fromứng. Khi thử nghiệm với 60 chủng E. coli, kỹ thuật 100 to 108 copies/reaction, the assay could detectMultiplex Real-time PCR có độ nhạy và độ đặc hiệu when the sample contains equal or more than 101đều là 100,0%. copies/reaction. Testing results with 60 strains of E. Kết luận: Kỹ thuật Multiplex Real-time PCR phát coli showed that the assay had both sensitivity andhiện đồng thời 4 gen kháng colistin từ mcr-1 đến specificity of 100.0%.mcr-4 có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, giới hạn Conclusions: The Multiplex Real-time PCRphát hiện của kỹ thuật là từ 101 đến 108 copies/ assay for simultaneous detection of 4 colistin-phản ứng. Do đó, kỹ thuật có thể áp dụng trong resistant genes from mcr-1 to mcr-4 had highchẩn đoán lâm sàng và giám sát sự lưu hành của sensitivity and specificity, and the limit detectionvi khuẩn mang gen kháng colistin trong cộng đồng. of the assay was from 101 to 108 copies/reaction. Từ khoá: kháng colistin, gen mcr, multiplex real- Therefore, the assay could be applied in clinicaltime PCR, phát hiện. diagnosis and monitoring the circulation of bacteria DEVELOPMENT OF A MULTIPLEX carrying colistin-resistant genes in the community.REAL-TIME PCR ASSAY FOR SIMULTANEOUS Keywords: colistin resistance, mcr gene,DETECTION OF FOUR COLISTIN RESISTANCE multiplex real-time PCR, detection.GENES FROM mcr-1 TO mcr-4 I. ĐẶT VẤN ĐỀ1. Trường Đại học Y Dược Thái Bình Colistin là kháng sinh quan trọng để điều trị đối* Tác giả chính: Nguyễn Nam Thắng với các trực khuẩn Gram âm đa kháng, đặc biệtEmail: thangnn@tbmc.edu.vn là những trường hợp kháng với carbapenems [1].Ngày nhận bài: 26/6/2024 Tình trạng vi khuẩn kháng colistin do sự xuất hiệnNgày phản biện: 28/6/2024 của gen mcr (mobile colistin resistant gene) hiệnNgày duyệt bài: 30/6/202432 TẠP CHÍ Y DƯỢC THÁI BÌNH, TẬP 12 SỐ 3 - THÁNG 9 NĂM 2024nay làm cho việc điều trị đối với các bệnh nhiễm Nghiên cứu được thực hiện tại Trung tâm Dịchtrùng do vi khuẩn Gram âm trở nên vô cùng khó vụ Khoa học kỹ thuật Y Dược, Trường Đại học Ykhăn. Để ngăn chặn sự lan truyền của vi khuẩn Dược Thái Bình trong thời gian từ tháng 10/2022kháng colistin trong bệnh viện và trong cộng đồng, đến tháng 06/2023.nhiều kỹ thuật vi sinh và sinh học phân tử đã được 2.2. Thiết kế nghiên cứuáp dụng để phát hiện kiểu hình hoặc kiểu gen Nghiên cứu được thực hiện theo phương phápkháng colistin ở vi khuẩn [2]. Các kỹ thuật sinh thực nghiệm.học phân tử (PCR; multiplex PCR; real-time PCR; 2.3. Các kỹ thuật áp dụng trong nghiên cứuWGS) được sử dụng để phát hiện gen mcr có cácưu điểm là độ nhạy, độ đặc hiệu cao, thời gian xét 2.3.1. Thiết kế primer, pro ...