Phát triển kỹ thuật reverse transcription polymerase chain reaction xác định virut Ebola

Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm thiết kế phản ứng RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) phát hiện đồng thời 5 loài virut Ebola, góp phần chẩn đoán nhanh, chính xác, kịp thời ngăn chặn và kiểm soát lây lan của dịch bệnh do virut Ebola.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Phát triển kỹ thuật reverse transcription polymerase chain reaction xác định virut EbolaT¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2016PHÁT TRIỂN KỸ THUẬT REVERSE TRANSCRIPTIONPOLYMERASE CHAIN REACTION XÁC ĐỊNH VIRUT EBOLANguyễn Văn An*; Nguyễn Thái Sơn*; Bùi Tiến Sỹ**Hoàng Xuân Sử***; Hồ Hữu Thọ***; Đinh Thị Thu Hằng***TÓM TẮTMục tiêu: thiết kế phản ứng RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) pháthiện đồng thời 5 loài virut Ebola, góp phần chẩn đoán nhanh, chính xác, kịp thời ngăn chặn và kiểmsoát lây lan của dịch bệnh do virut Ebola. Vật liệu và phương pháp: các trình tự toàn bộ bộ gen của5 loài virut Ebola được thu thập từ Ngân hàng dữ liệu GenBank. Sử dụng phần mềm tin sinh họcthiết kế mồi đặc hiệu với virut Ebola, thực hiện phản ứng RT-PCR với các cặp mồi vừa thiết kế trênmẫu ARN chuẩn dương và chuẩn âm bằng bộ kít One-Step RT-PCR (Thermo Fisher, Mỹ). Kết quả:thiết kế được 01 mồi xuôi (Ebo-pan-Fwd: GTGTGCGARTAACTAYGAGGAAG), 02 mồi ngược(Ebo-pan-Rev2: GGATGACTCTTTGYCGMACAAT, Ebo-pan-Rev3: GGCATGGCAGCMARTGTTCTC).Kết quả thực hiện phản ứng RT-PCR sử dụng bộ kít One-Step RT-PCR (Thermo Fisher, Mỹ)đối với chuẩn dương ARN của virut Ebola chủng Zaire Mayinga (giáo sư Jonas SchmidtChanasit ở Viện Y học Nhiệt đới Bernhard Nocht, Hamburg, Cộng hòa Liên bang Đức cungcấp) cho 2 băng đặc hiệu với Ebola có kích thước lần lượt là 541 bp, 830 bp; không xuất hiệnbăng đặc hiệu đối với mẫu chuẩn âm là virut Dengue. Kết luận: đã thiết kế thành công phảnứng RT-PCR chẩn đoán virut Ebola.* Từ khóa: Virut Ebola; RT-PCR; Zaire Ebola.Development and Validation of One-Step Reverse-TranscriptionPCR for Simultanous Detection of Five Ebolavirus SpeciesSummaryObjectives: To establish one-step RT-PCR for simultanous detection of five Ebolavirusspecies. Materials and methods: Full genome sequences of five Ebolavirus species retrievedfrom the Genebank for design of primers using Primer Express software. RT-PCR has beenoptimized and validated with the positive and negative standards using One-Step RT-PCR kit(Thermo Fisher, USA). Results and conclusions: We designed one forward primer and tworeverse primers with following sequences: Ebo-pan-Fwd: GTGTGCGARTAACTAYGAGGAAG,Ebo-pan-Rev2: GGATGACTCTTTGYCGMACAAT, Ebo-pan-Rev3: GGCATGGCAGCMARTGTTCTC,respectively. Primer pairs above were tested with the positive standard (Zaire Virut EbolaMayinga, kindly provided by Pr Jonas Schmidt-Chanasit, Bernhard Nocht Institute for TropicalMedicine, Hamburg, Germany) using One-Step RT-PCR kit. (Thermo Fisher, USA). Clear andspecific bands were detected at 354 bp for Ebo-pan-Rev2 and 830 bp Ebo-pan-Rev3, respectively.* Bệnh viện Quân y 103** Bệnh viện TWQĐ 108*** Học viện Quân yNgười phản hồi (Corresponding): Nguyễn Văn An (ank59hvqy@gmail.com)Ngày nhận bài: 30/06/2016; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 07/09/2016Ngày bài báo được đăng: 29/09/201674T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2016The specificity of this assay was 100% as verified by testing with RNA extracted from plasma inpatients infected with Dengue virus. Conclusion: We have developed and validated successfullyone-step reverse transcription-PCR for simultanous detection of five Ebolavirus species.* Key words: Ebolavirus; RT-PCR; Zaire Ebola.ĐẶT VẤN ĐỀVirut Ebola gồm 5 loài E. Sudan,E. Zaire, E. Bundibugyo, E. Taï Forest,E. Reston được phát hiện lần đầu tiên tạiTrung Phi năm 1976 từ hai đại dịch ởSudan và Congo [1]. Dịch virut Ebola(EVD) bùng phát ở Tây Phi từ cuối năm2013, là vụ dịch kéo dài nhất và gây tửvong nhiều nhất trong số các vụ dịch dovirut Ebola được ghi nhận từ trước đếnnay, đặc biệt lần đầu tiên dịch virut Ebolavượt ra khỏi ranh giới Trung Phi. Tínhđến ngày 27 - 03 - 2016, theo Tổ chức Ytế Thế giới (WHO), vụ dịch này đã có đến28.646 người mắc bệnh ở 10 quốc giakhác nhau, với số ca tử vong lên đến trên11.323 người [2]. Hiện nay trong cácphương pháp chẩn đoán Ebola, sinh họcphân tử là phương pháp có độ nhạy, độđặc hiệu cao, thời gian cho kết quả nhanh[3]. Có nhiều nghiên cứu đã sử dụng RTPCR (Reverse transcription-PCR) chẩnđoán Ebola như: Jonathan S sử dụng RTPCR phát hiện E. Sudan, E. Zaire trongmáu tại vụ dịch ở Uganda năm 2000 [4],Yohei Kurosaki sử dụng kỹ thuật RTLAMP(ReverseTranscription-LoopMediated Isothermal Amplification) đểchẩn đoán E. Zaire [5], Lui L sử dụngrealtime RT-PCR để chẩn đoán E. Zairetại vụ dịch ở Sierra Leone năm 2014 [6]...Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiếnhành thiết kế phản ứng RT-PCR chẩnđoán đồng thời cả 5 loài virut Ebola gópphần phát hiện nhanh, chính xác để kịpthời ngăn chặn và kiểm soát sự lây lancủa dịch virut Ebola.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁPNGHIÊN CỨU* Vật liệu:- Chuẩn dương: ARN tách từ tế bàolây nhiễm chủng virut Zaire EbolaMayinga do Viện Y học Nhiệt đớiBernhard Nocht (Harmbug, Đức) traotặng.- Hóa chất: tris base, Taq-polymerase,trizol (Sigma, Mỹ), kít QIAGEN One-StepRT-PCR.- Thiết bị: GeneAmp PCR System9700 ( ...