Phát triển phương pháp multiplex PCR phát hiện vi khuẩn Chlamydia trachomatis

Nghiên cứu được tiến hành nhằm phát triển phương pháp multiplex PCR phát hiện nhanh và chính xác vi khuẩn Chlamydia trachomatis. Các mẫu bệnh được khảo sát là của các bệnh nhân tới khám chữa bệnh tại bệnh viện Phụ sản Bắc Giang từ tháng 3 đến tháng 6 năm 2011,... Mời các bạn cùng tham khảo.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Phát triển phương pháp multiplex PCR phát hiện vi khuẩn Chlamydia trachomatisTẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌCPHÁT TRIỂN PHƯƠNG PHÁP MULTIPLEX - PCRPHÁT HIỆN VI KHUẨN CHLAMYDIA TRACHOMATISNguyễn Ngọc Chỉnh1, Phạm Đăng Bảng2, Trần Hậu Khang2, Đặng Xuân Nghiêm11Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, 2Trường Đại học Y Hà NộiNghiên cứu được tiến hành nhằm phát triển phương pháp multiplex PCR phát hiện nhanh và chính xác vikhuẩn Chlamydia trachomatis. Các mẫu bệnh được khảo sát là của các bệnh nhân tới khám chữa bệnh tạibệnh viện Phụ sản Bắc Giang từ tháng 3 đến tháng 6 năm 2011. Điều kiện tối ưu của phản ứng PCR nhằmphát hiện các đoạn DNA đặc thù của Chlamydia trachomatis bằng 5 cặp mồi CtP, CtM, CtR, NO, Chlamp vàcặp mồi đối chứng dương AR, đã được khảo sát và cho thấy nhiệt độ gắn mồi tối ưu của từng cặp mồi nằmtrong khoảng từ 53oC đến 57oC. Đồng thời, điều kiện tối ưu cho phản ứng Multiplex PCR với 4 cặp mồi: CtP,NO, Chlamp và AR đã được xác định là 56oC. Kết quả khảo sát tỷ lệ nhiễm bệnh ở các bệnh nhân đến khámphụ khoa ở bệnh viện Phụ sản Bắc Giang cho thấy có 31 mẫu dương tính trong số 251 mẫu nghiên cứu,chiếm 12,35%.Từ khóa: chẩn đoán nhanh, Chlamydia trachomatis, Multiplex PCRI. ĐẶT VẤN ĐỀBệnh nhiễm khuẩn đường sinh dục do viphương pháp có độ chính xác cao. Ratti vàkhuẩn Chlamydia trachomatis (C. trachomatis)cộng sự (1991) dùng cặp mồi Chlamp để xácđịnh vi khuẩn C. trachomatis [2]. Năm 1993,là bệnh phổ biến trên toàn Thế giới và có mứcđộ lây nhiễm cao. Theo Tổ chức Y tế Thế giới,Roosendaal và cộng sự đã so sánh độ nhạycủa phương pháp chuẩn đoán bằng PCR, sửmỗi năm có khoảng 90 triệu người mắc bệnhdo nhiễm vi khuẩn này. Nhiễm C. trachomatisdụng 4 cặp mồi AR, CtM, CtR, CtP để xácđịnh vi khuẩn C.trachomatis [3]. Đến nămlà nguyên nhân gây viêm vùng chậu, vớikhoảng 80% nữ giới và 70% nam giới nhiễm2006, Viroj cùng các cộng sự đã dùng cặp mồiC. trachomatis không biểu hiện triệu chứng,NLO để xác định các mẫu bệnh [1]. Mục tiêunghiên cứu nhằm khảo nghiệm, tối ưu hóa việcđây là nguyên nhân bệnh lây bệnh ra cộngđồng [1]. Vi khuẩn C. trachomatis là vi khuẩnứng dụng các cặp mồi đã công bố để phát hiệnvi khuẩn C. trachomatis bằng phương phápkí sinh nội bào, bệnh ít biểu hiện ra bên ngoàinên cần có biện pháp phát hiện nhanh viPCR; phát triển phương pháp multiplex PCRphát hiện vi khuẩn C. trachomatis và xác địnhkhuẩn để có biện pháp chữa kịp thời tránh gâytỷ lệ nhiễm C. trachomatis tại Bắc Giang bằngbiến chứng cho các bệnh nhân. Việc sử dụngcác cặp mồi đã nghiên cứu và công bố trênphương pháp multiplex PCR.thế giới để phát triển thành kít phát hiện vikhuẩn C. trachomatis ở các bệnh nhân làĐịa chỉ liên hệ: Đặng Xuân Nghiêm, khoa Công nghệ sinhhọc, Trường Đại học Nông nghiệp Hà NộiEmail: dxnghiem@hua.edu.vnNgày nhận: 12/01/2013Ngày được chấp thuận: 20/6/2013TCNCYH 83 (3) - 2013II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP1. Đối tượng20 mẫu DNA của vi khuẩn C. trachomatisthu thập và tách chiết tại Bệnh viện Da liễuTrung Ương được sử dụng để tối ưu hóaphản ứng PCR, 251 mẫu bệnh phẩm của cácbệnh nhân nữ đến khám phụ khoa tại bệnhviện Phụ sản Bắc Giang tình nguyện tham gia27TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌCnghiên cứu từ ngày 15/03/2011 đến ngàyvortex 30 giây, ủ 10 phút ở nhiệt độ phòng.13/05/2011.Sau đó, 200µl chloroform được thêm vào vàtrộn đều sao cho toàn bộ dung dịch trong ống2. Phương pháp2.1. Phương pháp thu thập mẫueppendorf chuyển thành màu trắng đục, hỗnhợp được ly tâm ở 4oC, 13000 vòng/phútMẫu bệnh phẩm của các bệnh nhân nữtham gia nghiên cứu được thu thập qua haitrong 10 phút. Dịch nổi được chuyển vào ốngeppendorf mới có sẵn 600µl isopropanol lạnh,dạng: nước tiểu và mẫu quệt cổ tử cung.Mẫu được bảo quản trong ống eppendorf cótrộn đều và ủ -20oC 30 phút. DNA được thuđệm PBS (Phosphate-buffered saline) và lytâm 14000 vòng/phút trong 15 phút trong 4oCbằng cách ly tâm 13000 vòng/phút trong 10phút và rửa bằng 900µl ethanol 70%, để khôđể thu các tế bào trong mẫu bệnh. Sau đó cácethanol ở nhiệt độ phòng và hòa tan bằng50µl dung dịch đệm TE 10mM, pH 8. Mẫutế bào được rửa bằng đệm PBS và bảo quảnở - 20oC.DNA được bảo quản ở - 20oC [4].Phương pháp sử dụng proteinase K và2.2. Phương pháp tách chiết DNAPhương pháp sử dụng Trizol: 200 µl mẫuđược trộn đều với 900 µl dung dịch Trizol pH 8,phương pháp đun sôi được tiến hành theonghiên cứu của Jenab và cộng sự (2010) [5].2.3. Tối ưu hóa điều kiện phản ứng PCR,Multiplex PCRBảng 1. Các mồi sử dụng trong nghiên cứuVị trí đoạn genđược nhânTên mồiKích thước(bp)Trình tự mồi (5’ – 3’)Chlamp - 1CCAAAGCTATTCAAAATCGGAGCTCTAAGAChlamp - 4GTCTTCTGCTTACAATGCTCTTGCATATTA610 - 612Nhiễm sắc thểvi khuẩnNLOATGAAAAAACTCTTGAAATCGNROCTCAACTGTAACTGCGTATTTAR1GGCGGTGACGGAGCTGGGGCGAR2CGCCGCTGCACTGTGAAGCTCCtP1TAGTAACTGCCACTTCATCACtP2TTCCCCTTGTAATTCGTTGCCtM1GCCGCTTTGAGTTCTGCTTCCTC1128DNA người153PlasmidG ...