Phát triển phương pháp phát hiện Ricin trong mẫu nước sử dụng Aptamer kết hợp với Real-time PCR

Bài viết này trình bày các nghiên cứu phát triển phương pháp phát hiện ricin sử dụng kỹ thuật real-time PCR dựa trên aptamer Ar 5.9 đặc hiệu ricin.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Phát triển phương pháp phát hiện Ricin trong mẫu nước sử dụng Aptamer kết hợp với Real-time PCR Nghiên cứu khoa học công nghệ PHÁT TRIỂN PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN RICIN TRONG MẪU NƯỚC SỬ DỤNG APTAMER KẾT HỢP VỚI REAL-TIME PCR Ngô Ngọc Trung1*, Nguyễn Thị Thu Thủy2, Lã Thị Huyền2, Lê Quang Huấn2 Tóm tắt: Ricin là một loại lecin thực vật, được tìm thấy nhiều trong hạt Thầu Dầu. Ricin gây độc cho tế bào động vật bằng cách thay thế một base adenine đơn trên cấu trúc vòng sarcin-ricin (SRL), từ đó làm thay đổi cấu trúc của tiểu đơn vị lớn rARN 28S, gây ức chế quá trình tổng hợp protein trong tế bào. Do vậy, ricin được xếp vào nhóm vũ khí sinh học nguy hiểm được sử dụng trong chiến tranh hoặc khủng bố. Phương pháp real time PCR là một trong những phương pháp phát hiện và định lượng ADN hiện đại nhất hiện nay. Các nghiên cứu sử dụng phương pháp real time PCR để phát hiện ricin trong mẫu lương thực, thực phẩm thông qua phát hiện ADN của đoạn gen mã hóa cho độc tố ricin. Tuy nhiên, chưa có nhiều công trình công bố về sử dụng phương pháp real time PCR để phát hiện trực tiếp ricin trong mẫu môi trường. Bài báo này trình bày các nghiên cứu phát triển phương pháp phát hiện ricin sử dụng kỹ thuật real-time PCR dựa trên aptamer Ar 5.9 đặc hiệu ricin. Kết quả nghiên cứu cho thấy phương pháp này có thể phát hiện ricin trong môi trường nước với ngưỡng phát hiện (LOD) là 0,36 ng, giới hạn định lượng (LOQ) là 1,32 ng/ml, độ nhạy với nước ngầm và nước mặt đạt 98%, nước sinh hoạt đạt 99%, độ đặc hiệu đạt 98%. Từ khóa: Ricin; Real-time PCR phát hiện Ricin; Aptamer đặc hiệu Ricin. 1. MỞ ĐẦU Ricin từ hạt thầu dầu là một loại glycoprotein thuộc nhóm lectin, có khối lượng phân tử khoảng 65 kDa. Phân tử gồm 02 chuỗi polypetid (chuỗi A và B) nối với nhau qua cầu nối disunfua (-S-). Sau khi xâm nhập vào tế bào, ricin được vận chuyển đến bộ máy Golgi và tại đây, chuỗi A sẽ tách khỏi phân tử ricin, đi vào nhân và đến ribosom. Chuỗi A làm thay đổi cấu trúc của tiểu đơn vị lớn rARN 28S bằng cách thay thế một base adenine đơn (A4324) trên cấu trúc vòng sarcin-ricin (SRL) [10], từ đó gây bất hoạt tiểu đơn vị này và gây ra ức chế quá trình tổng hợp protein trong nhân tế bào dẫn đến gây chết tế bào. Bên cạnh đó, ricin tinh sạch có các tính chất như không mùi, không vị, dễ tan trong nước và có thể tồn tại trong môi trường trong một thời gian dài. Các nghiên cứu còn cho thấy giá trị LD50 của ricin đối với động vật như Thỏ, Chuột nhắt trắng trong khoảng từ 1-5µg/kg [6]. Do vậy, ricin được liệt vào danh sách các chất cực độc dùng trong chiến tranh sử dụng vũ khí hủy diệt lớn hoặc khủng bố quy mô vừa và nhỏ [11]. Bởi vậy, phát triển các phương pháp phát hiện độc tố ricin là rất cần thiết, đảm bảo an toàn sinh học trong cộng đồng cũng như sử dụng trong huấn luyện sẵn sàng chiến đấu trong quân đội. Real-time PCR là một kỹ thuật được sử dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau, trong đó có ứng dụng phát hiện các vi sinh vật và độc tố gây bệnh cho người cũng như phát hiện các độc tố trong môi trường. Để phát hiện ricin, Xiahua He và cộng sự đã phát triển phương pháp ImmunoPCR (IPCR) sử dụng kháng thể đơn dòng kháng chuỗi A kết hợp với một đoạn ADN đã được biotin hóa. Sau khi gắn với ricin, đoạn ADN sẽ được tách ra và phát hiện bằng real-time PCR. Phương pháp này là sự kết hợp giữa ELISA và real-time PCR nên có độ nhạy cực cao với ngưỡng phát hiện là 10 pg ricin [6]. Tiếp theo, ông cũng phát triển phương pháp phát hiện ricin trong các mẫu thực phẩm như thịt bò, sữa, trứng với ngưỡng phát hiện đến 10 pg/ml [7]. Xiahua He cũng phát triển phương pháp real-time PCR để phát hiện trực tiếp genome của hạt thầu dầu trong thực phẩm với ngưỡng phát hiện là 0,5 µg ricin/1g mẫu [8]. Trong một nghiên cứu khác, Eva Felder và cộng sự đã phát Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số 59, 02 - 2019 151  Hóa học & Kỹ thuật môi trường hiện ricin trực tiếp trong hỗn hợp bột của hạt cây Thầu Dầu bằng phương pháp real-time PCR với độ nhạy là 3 copy tương đương với 3 tế bào/phản ứng [9]. Aptamer là các sợi đơn ADN hoặc ARN có cấu trúc đặc biệt và có khả năng gắn kết đặc hiệu với các phân tử đích khác nhau. Aptamer Ar5.9 là một đoạn ADN sợi đơn đặc hiệu ricin được sàng lọc dựa trên quy trình SELEX cải tiến sử dụng cột sàng lọc Nanosep 3K Omega [5]. Tính đặc hiệu cao của Ar5.9 với ricin là cơ sở để sử dụng phương pháp real-time PCR phát hiện ricin trong mẫu môi trường với sơ đồ sau: Hình 1. Sơ đồ phát hiện ricin dựa trên phương pháp Real-time PCR sử dụng aptamer Ar5.9. Các mẫu môi trường nước (nước mặt, nước ngầm, nước sinh hoạt) sau khi lấy về phòng thí nghiệm được xử lý mẫu và gắn kết protein trong mẫu lên đĩa 96 giếng. Ricin có bản chất là protein nên cũng được gắn lên đĩa một cách dễ dàng. Tiếp theo là quá trình rửa trôi các thành phần không gắn kết bằng đệm chuyên dụng, blocking đĩa để tránh các thành phần khác gắn lên. Aptamer Ar5.9 sau đó được thêm vào để gắn kết đặc hiệu với ricin trong giếng. Tiếp theo là quá trình rửa trôi các aptamer thừa, không gắn kết với các phân tử ricin. Hỗn hợp aptamer - ricin được biến tính nhiệt để loại bỏ gắn kết giữa ricin và aptamer Ar5.9, sau đó sử dụng phản ứng real-time PCR để phát hiện các aptamer Ar5.9 đã gắn kết với ricin. Từ đường chuẩn giữa aptamer Ar5.9 và ricin đã biết, có thể phát hiện ricin trong mẫu môi trường dựa vào phản ứng real-time PCR. Phương pháp này có thể phát hiện và định lượng ricin chính xác với thời gian thực hiện nhanh, thao tác dễ dàng với độ nhạy, độ đặc hiệu cao. 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu và hóa chất 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu Ricin tinh sạch, aptamer Ar5.9 được cung cấp bởi Viện Hóa học Môi trường quân sự. Trình tự của Aptamer Ar5.9: 5’ - ...