Phương pháp PCR

I. Phương pháp PCR1. Khái niệmPCR (Polymerase Chain Reaction) (Phản ứng Trùng Phân, Phản ứngchuỗi Polymerase, hay phản ứng PCR). Bản chất của PCR là sự tổng hợp nhântạo nhằm tạo ra các đoạn ADN mới.2. Các thành phần chính của PCRCác thành phần chính của PCR gồm: ADN khuôn, dNTP, Mồi (primer),enzym polymerase (Taq), MgCl2 và đệm PCRPhản ứng được thực hiện trong máy chu kỳ nhiệt, hay còn gọi là máyPCR....
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Phương pháp PCR Phương pháp PCR I. Phương pháp PCR 1. Khái niệm PCR (Polymerase Chain Reaction) (Phản ứng Trùng Phân, Phản ứngchuỗi Polymerase, hay phản ứng PCR). Bản chất của PCR là sự tổng hợp nhântạo nhằm tạo ra các đoạn ADN mới. 2. Các thành phần chính của PCR Các thành phần chính của PCR gồm: ADN khuôn, dNTP, Mồi (primer),enzym polymerase (Taq), MgCl2 và đệm PCR Phản ứng được thực hiện trong máy chu kỳ nhiệt, hay còn gọi là máyPCR. 2.1. ADN khuôn ADN khuôn (DNA template) hay còn gọi là ADN mục tiêu được sử dụnglàm cái khuôn để các mồi PCR gắn vào vị trí bổ sung với nó, sau đó với sự thamgia của các thành phần cần thiết, phản ứng tổng hợp sẽ diễn ra tạo lên mộtđoạn ADN mới giống hệt đoạn ADN nằm giữa hai vị trí gắn mồi. Từ chu kỳthứ hai trở đi, ngoài ADN khuôn ban đầu, những đoạn ADN vừa được tổng hợpcũng được sử dụng làm khuôn cho những chu kỳ tổng hợp tiếp theo. Lượng ADN khuôn rất nhỏ khoảng từ 20ng đến 100ng. Do lượng ADNcần thiết nhỏ như vậy, nên khi chuẩn bị ADN khuôn phải hết sức chú ý tránh bịlẫn ADN từ các nguồn khác và cần phải có ADN khuôn với độ nguyên vẹn cao. 2.2. Mồi PCR Mồi là một đoạn oligonucleotít ngắn, có chiều dài khoảng từ 6 đến 70nucleotít. Những mồi ngẫu nhiên (mồi RAPD) có chiều dài khoảng 10 nucleotít vàđa số các mồi PCR có chiều dài khoảng 20 dến 30 nucleotít. - Thiết kế mồi Khi thiết kế mồi, người ta thường quan tâm sao cho không có sự bổ sunggiữa các bazơ trong cùng một mồi và giữa các mồi. Vì phản ứng tổng hợp đượcbắt đầu từ đuôi 3’ của mồi; do vậy để nâng cao hiệu quả gắn mồi và tính đặchiệu của phản ứng, người ta thường quan tâm đến việc thiết kế sao cho đuôi 3’của chúng là các bazơ G hoặc C để tạo ra sự bắt cặp chắc hơn và đặc hiệu hơnso với cặp A và T. - Nhiệt độ gắn mồi 1 Trong PCR phải tìm được nhiệt độ thích hợp nhất cho mồi gắn vào ADNkhuôn. Để xác định nhiệt độ gắn mồi tương đối ban đầu, người ta đã dựa trênnhững công thức toán khác nhau. *Đối với những mồi có chiều dài ≤ 20 bazơ thì nhiệt độ gắn mồi đượctính theo công thức sau: Tm ( oC) = {2 x (A + T) + 4 x (G + C)} VD: một mồi có trình tự nucleotide như sau: CAG CAA ATA TCT GTCCTT AC, nhiệt độ gắn mồi tương đối sẽ là: Tm = 2 x 12 + 4 x 8 = 56 oC. *Đối với những mồi có chiều dài từ 20 đến 35 bazơ thì nhiệt độ gắn mồiđược tính theo công thức: Tm ( oC) = 22 + 1,46 x {[2 x (C +G) + ( A + T)]} *Đối với những mồi có chiều dài từ 35 đến 70 bazơ thì nhiệt độ gắn mồiđược tính theo công thức: Tm ( oC) = 81,5 + 16.6 log10C+ + 0,41 (% của G + C) – 600/L. C+ là nồng độ của cation hoá trị một (Na+), tính theo nồng độ của phân tử;L là chiều dài mồi. Trong thực tế nhiệt độ gắn mồi có thể dao động từ 30C đến 150C so vớinhiệt độ tính toán được từ các công thức. Các công thức nêu trên chỉ để thamkhảo; nhiệt độ gắn mồi tối ưu được rút ra qua thí nghiệm cụ thể. + Nồng độ mồi Nồng độ mồi có thể được sử dụng vào khoảng 100 đến 500 nM. Tuynhiên nồng độ cụ thể phụ thuộc vào từng thí nghiệm và mục đích nghiên cứu.Nếu nồng độ mồi quá thấp sẽ không đủ cho phản ứng và nồng quá cao có thểdẫn tới sai lệch kết quả. + Thời gian gắn mồi Thời gian gắn mồi vào khuôn thường dao động trong khoảng 30 đến 60giây. Nếu thời gian gắn mồi lâu sẽ gây ra sai lệch kết quả phản ứng do sự gắnmồi không đặc hiệu, hơn nữa sẽ kéo dài thời gian phản ứng làm suy giảm sựhoạt động của enzym Taq. 2.3. dNTP dNTP (A, T, G, C là những “viên gạch” để xây dựng lên sợi ADN mớitrong phản ứng chuỗi. Nồng độ của dNTP thường sử dụng cho mỗi phản ứng là200µ M. Nếu nồng độ dNTP quá cao nó sẽ liên kết với Mg2+, một ion rất cầncho sự hoạt động của enzym tổng hợp, vì vậy mà sẽ ảnh hửng tới phản ứngtổng hợp. dNTP rất nhậy cảm với sự thay đổi nhiệt độ, cứ sau 35 chu kỳ củaPCR thì dNTP hầu như đã bị suy giảm; trong một môi trường axít nó sẽ chuyển 2hoá nhanh thành dNDP và dNMP. Do vậy mà dNTP là chất không bền, đặc biệtsử dụng cho PCR. 2.4. Enzym tổng hợp ADN. Là một thành phần quan trọng của phản ứng PCR. Trong điều kiện thíchhợp cùng với các thành phần cần thiết khác, enzym hoạt động tổng hợp nênADN mới. Nồng độ sử dụng enzym phụ thuộc vào mỗi loại enzym và thuộc tínhcủa nó; có thể sử dụng từ 1 đến 2 đơn vị enzym sẽ cho hiệu quả tốt nhất vớiPCR có thể tích 25µ l. Nếu quá nhiều enzym có thể sẽ làm tăng nồng độ glyceroltrong dung dịch phản ứng, dẫn tới quá trình tổng hợp không đồng đều giữa cácvị trí và tạo ra hình ảnh điện di không rõ nét. Ngược lại, nếu quá ít sẽ thiếuenzym và kết quả nhận được là sản phẩn tổng hợp không đầy đủ. 2.5. Dung dịch đệm PCR Dung dịch đệm chung nhất của PCR bao gồm các thành ...