Sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử xác định vi khuẩn anammox trong sinh khối của hệ thống làm giàu anammox tại viện nghiên cứu da giầy, bộ công thương

Với mục đích xác định sự có mặt của vi khuẩn anammox trong sinh khối của hệ thống làm giàu anammox bằng phương pháp tách dòng và giải trình tự gen 16S của vi khuẩn, nhân bản và giải trình tự gen hzsA (hydrazine oxidoreductase subunit A) một gen đặc trưng của vi khuẩn anammox.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử xác định vi khuẩn anammox trong sinh khối của hệ thống làm giàu anammox tại viện nghiên cứu da giầy, bộ công thươngTạp chí phân tích Hóa, Lý và Sinh học - Tập 20, Số 1/2015SỬ DỤNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ XÁC ĐỊNH VI KHUẨNANAMMOX TRONG SINH KHỐI CỦA HỆ THỐNG LÀM GIÀU ANAMMOXTẠI VIỆN NGHIÊN CỨU DA GIẦY, BỘ CÔNG THƢƠNGĐến tòa soạn 14 – 7 – 2014Trần Văn Vinh, Nguyễn Đức Quang, Nguyễn Bá Cường,Viện Nghiên cứu Da giầy Việt NamVũ Thi Ngọc BíchĐơn vị nghiên cứu lâm sàng Đại học Oxford – Hà NộiHà Thị ThuViện Công Nghệ Sinh Học, Viện Hàn lâm Khoa học Việt NamTrịnh Lê HùngKhoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà NộiSUMMARYRESEARCH ON IDENTIFYING OF ANAMMOX BACTERIA IN THEBIOMASS OF ANAMMOX ENRICHMENT SYSTEM IN LEATHER ANDSHOE RESEARCH INSTITUTE, MINISTRY OF INDUSTRY AND TRADEUSING MOLECULAR BIOLOGY TECHNIQUESAnammox is one of the newly found drivers known to contribute to the biogeochemicalnitrogen cycle. In the marine environment, more than 50% of nitrogenous compoundsare reportedly converted into nitrogen gas via the anammox pathway. Several methodshave been used to detect the presence and activity of anammox bacteria in theenvironment, including 16S rRNA gene-based approaches or based on their lipids,functional genes, and unique reaction pathways. Here, we report a molecular methodusing the primer sets that were published for detecting the genes encoding 16S rRNAgene and subunit of the hydrazine oxidoreductase (hzsA) in anammox bacteria. 16SrRNA gene sequences and hzsA gene sequences were retrieved from anammox enrichment cultures system in center of analysis and environmental technology, Leatherand Shoe Research Institute, Ha Noi. All sequences were demonstrated that anammoxbacteria which were belonged to Candidatus Brocadia genus presented in our system.71. ĐẶT VẤN ĐỀAnammox là tên viết tắt bảy chữ cái đầu củacụm từ Anaerobic Ammonium Oxidation,một quá trình quan trọng trong vòng tuầnhoàn Nito được thực hiện bởi các vikhuẩn [1].Anammox là vi khuẩn tự dưỡng, chúngsử dụng CO2, hoặc HCO3- làm nguồnCarbon. Những phân tích trong hệ gencủa chúng cho thấy chúng cố định CO2theo con đường acetyl-CoA. Năng lượngsinh ra từ con đường này được dùng đểchuyển hóa nitrit và ammoni trực tiếpthành Nitơ. Quá trình sinh học này sinhra Nito đã đóng góp khoảng 50% khíNitơ được sinh ra từ đại dương [2-5].Đây là điểm đặc trưng mà nhờ đóanammox đóng vai trò đặc biệt quantrọng trong việc xử lý ammoni trongnước thải sinh hoạt và công nghiệp vàhiện đang được nghiên cứu ứng dụngrộng rãi ở các nước như Hà Lan, NhậtBản, Đức và Trung Quốc [2, 5-8].Vi khuẩn Anammox được xếp vào ngànhPlanctomycetes, lớp Planctomyces, bộPlanctomycetales, họ Planctomycetaceaevới 5 chi khác nhau là Brocadia,Kuenenia,Anammoxoglobus, Jettenia, và Scalindua.Hầu hết chúng được tìm thấy trong quátrình xử lý nước thải bằng phương phápsinh học hoặc sống trong môi trườngkhoáng yếm khí. Cho tới nay người tavẫn chưa phân lập được chúng bằngphương pháp nuôi cấy vi sinh. [6, 7, 9]Vi khuẩn anammox sinh trưởng rấtchậm, chu kỳ nhân đôi tế bào của chúngkéo dài từ 11- 20 ngày có loài còn kéo8dài hơn. Trong tự nhiên, chúng là vikhuẩn yếm khí bắt buộc và bị ức chếsinh trưởng ở nồng độ oxy 2 µM. Vì thế,cho tới nay chưa có bất kỳ bằng chứngnào về việc nuôi cấy, phân lập được cácvi khuẩn annamox trong phòng thínghiệm [6, 7]. Song có rất nhiều nghiêncứu về các đặc điểm sinh vật, hóa họccủa vi khuẩn anammox. Hầu hết cácnghiên cứu chứng minh cấu trúc tế bào,quá trình sinh trưởng, các cơ chế quantrọng và trình tự bộ gen của chúng [7].Năm 2005, bằng việc ứng dụng phươngpháp lai phân tử có gắn huỳnh quang đểxác định gen 16S của vi khuẩnanammox, Schmid và cộng sự đã xácđịnh được các vi khuẩn anammox thuộcchi Candidatus. Kuenenia và CandidatusScalindua trong môi trường [10].Candidatus là một thuật ngữ được sửdụng trong phân loại học đối với các vikhuẩn không nuôi cấy phân lập được.Mặc dù nhóm nghiên cứu đã rất thànhcông trong việc thiết kế các cặp mồi đặchiệu để xác định vi khuẩn anammoxtrong các môi trường khác nhau nhưngphương pháp này vẫn tồn tại những hạnchế do tính bảo tồn thấp hơn của cáctrình tự gen 16S trong vi khuẩnanammox. Trong một nghiên cứu kháccủa Penton và cộng sự năm 2006, cáccặp mồi cho phản ứng lai in situ đượcđánh giá là đặc hiệu và nhạy hơn cũngđã được thiết kế để định danh anammox[11]. Mặc dù vậy, những cặp mồi nàycũng bắt cặp cả với các gen 16S củanhững vi khuẩn không thuộc họplanctomycete. Trong khi gen 16S vẫntiếp tục được sử dụng như một markersinh học để xác định vi khuẩn anammoxthì gần đây việc xác định vi khuẩnanammox dựa vào các gen cấu trúc đặctrưng khác của chúng.Năm 2006, nhờ vào phương pháp giảitrình tự gen và phân tích trình tự củamột hệ các vi khuẩn khác nhau trongmột quần xã vi khuẩn được gọi làphương pháp Sequencing batch reactor(SBR) mà bộ gen của CandidatusKuenenia stuttgartiensis một chi của vikhuẩn anammox được giải mã 74% [6,12]. Nhờ vào kết quả này đã tạo dựngcơ sở cho việc nghiên cứu các gen chứcnăng khác của vi khuẩn anammox.Dựa vào bộ gen thu được các nhà nghiêncứu đã đưa ra giả thuyết về cơ chếchuyển hóa amoni yếm khi dưới xúc táccủa enzyme hydrazine oxidoreductase(hzo). Bước đầu tiên trong quá trình đólà việc khử NO3- thành NO2- dưới tácdụng của enzyme nitrite oxidoreductase,enzyme tổng hợp hydrazine sinh rahydrazine từ NO2- và ammoni, cuối cùnglà hydrazine được chuyển hóa thành khínito N2 xúc tác của enzyme hydrazineoxidoreductase (hzo). Các nghiên cứugần đây đã đưa ra những bằng chứngmột cách rất đầy đủ về cấu trúc củaenzyme hzo cũng như cơ chế xúc tác củanó trong quá trình amoni yếm khí [13].Enzyme hzo được mã hóa bởi nhóm genhzsA, hzsB, hzsC, các gen hzo cũngđược tìm thấy trong một loạt các chi vikhuẩn anammox trong các môi trườngkhoáng bao gồm cả các chi mới pháthiện như Cand ...