Tách dòng Gen LTP (Lipid transfer protein) của cây đậu xanh

Nghiên cứu gần đây cho thấy sự mở rộng in vitro các hợp tử cellulose xyloglucan của thành tế bào thực vật có thể được gây ra do các LTP; Mặc dù chưa có bằng chứng in vivo song khám phá này chắc chắn sẽ đem lại các câu hỏi thú vị về cơ chế mở rộng thành tế bào thực vật
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Tách dòng Gen LTP (Lipid transfer protein) của cây đậu xanh52(4): 94 - 98Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ4 - 2009TÁCH DÒNG GEN LTP (Lipid transfer protein) CỦA CÂY ĐẬU XANH(Vigna radiata L. Wilczek)Chu Hoàng Mậu (Đại học Thái Nguyên),Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Trần Thúy Liên, Nguyễn Thị Mai Lan(Trường ĐH Khoa học - ĐH Thái Nguyên)I. Mở đầuĐậu xanh (Vigna radiata L. Wilcrek) là câytrồng cạn có vai trò quan trọng bởi hạt đậu xanh làthực phẩm giàu protein và trồng đậu xanh có tácdụng cải tạo đất. Với các điều kiện khí hậu khắcnghiệt như hạn hán, nóng nắng kéo dài làm chocây trồng nói chung và cây đậu xanh nói riêng suygiảm khả năng sinh trưởng, phát triển và có thểcây bị chết, dẫn đến giảm năng suất, chất lượnghạt đậu xanh. Chính vì vậy, vấn đề tìm kiếm cácchỉ thị phân tử của tính chống hạn và nghiên cứuứng dụng công nghệ gen nhằm tạo cây chuyển genchịu hạn là rất cần thiết.Các nghiên cứu đều cho rằng khi cây gặp hạncó hiện tượng tăng lên về hàm lượng ABA, hàmlượng proline, nồng độ ion K+, các loại đường, axithữu cơ,... giảm phức hợp CO2, protein và các axitnucleic [1], [2]. Sự tổng hợp và tích luỹ các chấttrên diễn ra rất nhanh khi tế bào bị mất nước, vớihai chức năng là (i) sự điều chỉnh áp suất thẩmthấu nhờ khả năng giữ nước và lấy nước vào tếbào và (ii) ngăn chặn sự xâm nhập của ion Na + củacác chất đó. Chúng có thể thay thế vị trí nước nơixảy ra các phản ứng hóa sinh, tương tác với lipidhoặc protein trong màng, ngăn chặn sự phá hủymàng và các phức protein trong màng. Như vậy khảnăng giữ nước của tế bào liên quan đến sự tăng ápsuất thẩm thấu và độ bền vững của màng tế bào.LTP (Lipid transfer proteins) thuộc họ genpathogenesis - relate, có khả năng tổng hợp proteinthúc đẩy quá trình vận chuyển phospholipid tớimàng. LTP còn hỗ trợ việc tạo ra lớp sáp hoặc lớpbiểu bì giúp thực vật bảo vệ, phản ứng và đáp ứnglại những thay đổi của môi trường [5], [10].Nghiên cứu gần đây cho thấy sự mở rộng in vitrocác hợp tử cellulose xyloglucan của thành tế bàothực vật có thể được gây ra do các LTP; Mặc dùchưa có bằng chứng in vivo song khám phá nàychắc chắn sẽ đem lại các câu hỏi thú vị về cơ chếmở rộng thành tế bào thực vật [7].Những phân tử protein do gen LTP tổng hợpthường có nhiều đặc điểm chung như: điểm đẳngđiện cao, khối lượng phân tử khoảng 9,12 kDa, vàvới sự có mặt của 8 phân tử cysteine làm nhiệm vụtạo ra 4 cầu nối disulfide [11]. Khi gặp những điềukiện cực đoan của môi trường, các nhân tố nhưhormone, các quá trình trao đổi ion, các con đườngtruyền tín hiệu … sẽ điều khiển gen LTP hoạtđộng và tăng tổng hợp nên các sản phẩm proteintăng cường vận chuyển phospholipid tới màng,tăng khả năng giữ nước của màng tế bào nhằmgiúp cho cây tăng khả năng chống stress hạn.Trong những năm gần đây, đã có một số côngtrình nghiên cứu về gen LTP ở các đối tượng thựcvật, như Solanales lycopersicum L. [11], Zea maysL. [8], Papper [4], Triticum L. [6], Daucus carotaL. [9], và Oryza satyva L. [12]. Trong bài báo này,chúng tôi công bố kết quả tách dòng gen LTPkhuếch đại từ ADN hệ gen của một số giống đậuxanh có khả năng chịu hạn khác nhau.II. Vật liệu và phương pháp nghiên cứuVật liệu nghiên cứuBảy giống đậu xanh do Trung tâm Nghiên cứuvà Phát triển Đậu đỗ - Viện Cây lương thực vàCây thực phẩm - Viện Khoa học Nông nghiệp ViệtNam cung cấp được sử dụng làm vật liệu nghiêncứu (Bảng 1).Bảng 1. Một số đặc điểm hình thái của 7 giống đậuxanh nghiên cứuMàuvỏ hạtKhối lượng1000 hạt (g)DX208Đỗ QuếDX14MàuthânmầmXanhXanhXanhXanh bóngXanh mốcXanh mốc75,30±0,01544,20±0,02565,86±0,040456DX04V123T135XanhXanhXanhXanh bóngXanh bóngXanh mốc66,31±0,01563,95±0,02050,54±0,0327PAEC3TímVàng bóng60,75±0,010STTTêngiống123152(4): 94 - 98Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆCặp mồi nhân gen LTP được chúng tôi thiết kếvà đặt tổng hợp tại hãng Invitrogen có trình tựtrình bày ở bảng 2.Bảng 2. Trình từ cặp mồi nhân gen LTPMồiLTPFTrình tự mồi (5’-3’)ATGGCTAGCCTGAAGGTTGCLTPRTTACTTGATGTTAGCGCAGTTPhương pháp nghiên cứu- ADN tổng số được tách chiết theo phươngpháp Gawel và Jarnet (1991) [3].- Nhân gen LTP bằng kỹ thuật PCR. Sản phẩmPCR nhân gen LTP được kiểm tra bằng điện ditrên gel agarose 1% trong TAE 1X.- Sản phẩm PCR của gen LTP được kiểm trabằng điện di trên gel agarose 1%. Gen được làmsạch bằng bộ Kit của hãng Bioneer và gắn trực tiếpvào vector pBT, sau đó được biến nạp vào tế bàokhả biến E. coli chủng DH5. Tách plasmid manggen LTP phục vụ cho đọc trình tự gen bằng bộ KitAccuPrep Plasmid Extraction của hãng Bioneer.Để nhân được đoạn gen này, chúng tôi đã tiếnhành tách chiết DNA tổng số. Tối ưu nhiệt độ vàthành phần của phản ứng PCR (Bảng 3). Nhiệt độgắn mồi thích hợp nhất cho nhân gen LTP là 560C.Bảng 3. Thành phần của phản ứng PCR nhân gen LTPDo chưa có trình tự nucleotide của gen LTPphân lập từ DNA tổng số nên chúng tôi dựa vàocơ sở dữ liệu khai thác từ ngâ ...