Tách dòng và xác định trình tự của gene crtY mã hóa cho Lycopene cyclase từ Pantoea ananatis

Nghiên cứu này của chúng tôi là tách dòng và xác định trình tự của gene crtY từ vi khuẩn Pantoea ananatis. Gene crtY được tách dòng có chiều dài 1161 bp với trình tự tương đồng 100% với trình tự gene crtY phân lập từ vi khuẩn Pantoea ananatis đã công bố trên ngân hàng gene NCBI mã số D90087.2 . Kết quả của nghiên cứu này là tiền đề cho mục tiêu tạo chủng E. coli có khả sản xuất ß-carotene.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Tách dòng và xác định trình tự của gene crtY mã hóa cho Lycopene cyclase từ Pantoea ananatisĐỗ Mạnh Cường và đtgTạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ83(07): 55 - 58Đỗ Mạnh Cường, Nguyễn Xuân Vũ*, DươngVăn CườngTÁCH DÒNG VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNHTỰ CỦA GENE CRTYMÃ HÓA CHO LYCOPENE CYCLASETỪ PANTOEA ANANATISTrường Đại học Nông Lâm - ĐH Thái NguyênTÓM TẮTß-carotene, một hợp chất carotenoid, có vai trò là tiền chất vitamin A, tăng cường hệ miễn dịch và chốngmột số bệnh ung thư ở đường tiêu hóa. ß-carotene được sử dụng nhiều trong y tế, công nghiệp thựcphẩm, dược phẩm và mỹ phẩm. Việc cung cấp ß-carotene từ các nguồn tự nhiên có một số yếu điểm nhưthiếu tính chủ động phụ thuộc vào thời vụ và chi phí cao. Do vậy, nhu cầu đặt ra là cần xây dựng nguồncung cấp ß-carotene nhân tạo. Trong con đường sinh tổng hợp ß-carotene, enzyme lycopene cyclase,được mã hóa bởi gene crtY, xúc tác phản ứng chuyển hóa lycopene thành ß-carotene. Nghiên cứu nàycủa chúng tôi là tách dòng và xác định trình tự của gene crtY từ vi khuẩn Pantoea ananatis. Gene crtYđược tách dòng có chiều dài 1161 bp với trình tự tương đồng 100% với trình tự gene crtY phân lập từ vikhuẩn Pantoea ananatis đã công bố trên ngân hàng gene NCBI mã số D90087.2 . Kết quả của nghiêncứu này là tiền đề cho mục tiêu tạo chủng E. coli có khả sản xuất ß-carotene.Từ khóa: ß-carotene, pro-vitamin A, crtY, Lycopene cyclaseĐẶT VẤN ĐỀ*Carotenoid là nhóm sắc tố tự nhiên được tổnghợp chủ yếu trong thực vật, tảo, vi khuẩn vànấm [9]. Carotenoid có vai trò trong hình thànhmàu sắc, che chắn ánh sáng và hình thành mộtsố hormone [10]. Trong công nghiệpcarotenoid được dùng làm dược phẩm, thựcphẩm dinh dưỡng, chất phụ gia thức ăn chođộng vật, phẩm màu làm mỹ phẩm và thựcphẩm [5]. Do khả năng chống oxi hóa,carotenoid mang lại lợi ích cho sức khỏe con*người, bảo vệ da dưới tác động của ánh nắngmặt trời, tăng cường chức năng hệ miễn dịch,ngăn ngừa hay làm chậm quá trình phát bệnhcủa các bệnh mãn tính có tác dụng trongđiều trị và phòng ngừa một số bệnh ung thư[3,5,6].ß-carotene, với vai trò là tiền chất vitamin A,tăng cường hệ miễn dịch và chống một sốbệnh ung thư [1] đã trở thành một trongnhững chất được quan tâm nhất trong nhómcarotenoid. Cơ thể con người không tự tổnghợp được ß-carotene mà phải hấp thụ từ thứcăn [2].Tel: 0915565282; Email: vubio@yahoo.comSố hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên55http://www.lrc-tnu.edu.vnĐỗ Mạnh Cường và đtgTạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ83(07): 55 - 58tổng hợp bởi hãng Alpha DNA. Các hoá chấtsử dụng trong các thí nghiệm được cung cấp từcác hãng Merk, Sigma và Invitrogen.Bảng 1. Cặp mồi sử dụng nhân gene CrtY.Tên mồiCrtY-FHình 1. Con đường sinh tổng hợp các chấtcarotenoidCrtY-RTrình tự5’TGAATTCAGGAGGTGTCTTAAATGGGAGCGGCTAT3’5’GCAAGCTTTTAACGATGAGTCGTCATAATGG3’Tất cả carotenoid đều được xây dựng từ đơnphân Isopentenyl diphosphate (IPP) vàdimethylallyl diphosphate (DMAPP). Hiện nayđã có hơn 20 gene crt chịu trách nhiệm tổnghợp nên các enzyme xúc tác quá trình tổnghợp carotenoids được tách dòng từ các loạisinh vật như vi khuẩn, vi khuẩn lam, nấm, tảocho đến thực vật bậc cao [4]. Một trong nhữngvi khuẩn có thể cung cấp các gene enzyme đểtổng hợp carotenoid là vi khuẩn Pantoeaananatis (trước đây gọi là Erwinia uredevora)[8]. ß-carotene được tổng hợp từ lycopene nhờenzyme lycopene cyclase được mã hóa bởigene crtY (Hình 1).Với mục tiêu tạo chủng E. coli có khả năng sảnxuất β-carotene, chúng tôi tiến hành tách dòngvà xác định trình tự gene crtY từ Pantoeaananatis.VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁPNGHIÊNCỨUVi khuẩn Pantoea ananatis (có DNA được sửdụng làm khuôn cho phản ứng PCR) được muatừ hãng DSMZ (Deutsche Sammlung vonMikroorganismen Zellkulturen GmbH). Vikhuẩn E.coli DH5α được cung cấp bởi ViệnCông nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Côngnghệ Việt Nam dùng làm vật chủ cho quá trìnhbiến nạp. Chúng tôi sử dụng vector tách dòngpLUG® TA-cloning và các bộ KIT DNAspinTM Plasmid DNA Puification, MEGAspinTM Agarose Gel Extraction mua từ hãngiNtRON BiotechnologyTM cho các bước thínghiệm. Cặp mồi dùng trong PCR (bảng 1)được thiết kế dựa trên trình tự các nucleotid ở2 đầu gene CrtY đã được công bố trên ngânhàng gene NCBI mã số D90087.2 và đượcVi khuẩn Pantoea ananatis dạng đông khôđược nuôi phục hồi theo hướng dẫn của nhàcung cấp, sau đó được nuôi trong môi trườngNutrient Broth ở điều kiện hiếu khí, nhiệt độ250C, lắc 120 vòng/phút trong 16h. Dịch vikhuẩn được ly tâm 4000 vòng/phút trong 8phút để thu cặn tế bào. 2 µl cặn tế bào đã phaloãng 10 lần được sử dụng làm khuôn choPCR. Chương trình PCR được thiết lập 25 chukỳ, mỗi chu kỳ bao gồm 3 bước biến tính 950C45 giây, gắn nối 550C 45 giây, và kéo dài 720C90 giây. Sản phẩm PCR được điện di trên gelagarose 1% sau đó chiết lại sử dụng bộ KITMEGA- spinTM Agarose Gel Extraction theohướng dẫn của nhà sản xuất. Phản ứng gắn nốiTA giữa sản phẩm PCR với vector pLUG ởnhiệt độ 160C ...