Tái tổ hợp Trichobakin và immunotoxin: Phần 2

Phần 2 Tài liệu Trichobakin và immunotoxin tái tổ hợp tiếp tục giới hiệu đến bạn đọc nội dung tiếp theo từ chương VI đến chương X về các vấn đề: Thay đổi trình tự Amino acid và ái lực của Trichobakin tái tổ hợp và các dẫn xuất đối với Cm- sepharose, nhận dạng, xác định TBK tái tổ hợp và các dẫn xuất trên hệ khối phổ maldi-tof ms và ms/ms, quy trình lên men, tinh chế và bảo quản TBK và các dẫn xuất ở qui mô 5 lit,... và các nội dung khác. Tài liệu là Tài liệu để giảng dạy cho các sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu sinh các chuyên ngành sinh học, công nghệ sinh học và bạn đọc quan tâm đến lĩnh vực này.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Tái tổ hợp Trichobakin và immunotoxin: Phần 2 133 Chương VI THAY ĐỔI TRÌNH TỰ AMINO ACID VÀ ÁI LỰC CỦA TRICHOBAKIN TÁI TỔ HỢP VÀ CÁC DẪN XUẤT ĐỐI VỚI CM-SEPHAROSE Chương V đã được giới thiệu với các kết quả thiết kế tạo một số dạng protein lai tái tổ hợp trên cơ sở trình tự gen mã hóa cho Trichobakin (TBK) gồm hai dạng chính: (i) biến đổi về trình tự amino acid ở đầu amino (đầu N) tạo các protein lai PBL-2 (ATF- TBK), PBL-3 (GnRH-TBK), PBL-5 (TGF-TBK) và (ii) biến đổi tại đầu carboxyl (đầu C) trong trường hợp PBL-4 (mini-TBK). Các dẫn xuất của TBK này đã được biểu hiện ở E. coli và đã được xác định, tinh chế. Chương VI tiếp theo sẽ trình bày một số kết quả nghiên cứu về sự thay đổi cấu trúc bậc một của TBK và các dẫn xuất đối với một số đặc tính hóa lý như khối lượng phân tử, pI và ái lực của các protein tái tổ hợp đối với CM-Sepharose. 6.1. Mức độ biểu hiện của TBK và các dẫn xuất Để biểu hiện protein, các vector biểu hiện tái tổ hợp sau khi được thiết kế (pQV, pGnRH-TBK, puPA-TBK và pMTBK), được biến nạp vào chủng vi khuẩn E. coli BL21(DE3) và nuôi cấy trong môi trường LB lỏng có cảm ứng bằng IPTG. Các mẫu tế bào được thu tại các thời điểm 0, 1, 2, 3 giờ sau khi cảm ứng. Dịch chiết protein tổng số của các mẫu tế bào được phân tích bằng SDS-PAGE. Kết quả điện di SDS-PAGE cho thấy, trong dịch chiết protein tổng số của các mẫu tế bào thu tại các thời điểm khác nhau sau khi được cảm ứng bằng IPTG, có xuất hiện một băng protein mới có trọng lượng phân tử phù hợp với kết quả tính toán lý thuyết đối với từng trường hợp cụ thể. Để có thể khẳng định mức độ biểu hiện trên, phản ứng Western blot đã được tiến hành, kiểm tra với tất cả các mẫu biểu hiện với kháng thể kháng TBK. Các clone biểu hiện đều 134 Phan Văn Chi, Nguyễn Bích Nhi cho kết quả dương tính, điều đó cho thấy đã thu được các protein tái tổ hợp mong muốn (Phan Van Chi et al, 2001a; Lê Thị Bích Thảo et al, 2002; Đặng Thành Nam et al, 2003; Lê Thị Bích Thảo et al, 2003, 2007). Tế bào E. coli chủng BL21(DE3) chứa vector biểu hiện pQV, pGnRH-TBK, puPA-TBK và pMTBK đã được chứng minh là có khả năng biểu hiện protein ổn định, tiếp tục được sử dụng làm đối tượng trong nghiên cứu này. Để có thể thu được các protein tái tổ hợp ở dạng tan, đồng thời xây dựng quy trình tinh sạch, nhằm phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo thì việc xác định điều kiện biểu hiện thích hợp là hết sức cần thiết. Trong phạm vi nghiên cứu của mình, chúng tôi tiến hành khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự biểu hiện của những protein tái tổ hợp ở dạng tan. Sự biểu hiện của cả 4 loại protein nói trên được tiến hành khảo sát ở 22, 30 và 37oC. Tế bào được nuôi cấy trong môi trường LB lỏng trong các bình tam giác giống nhau, lắc 200 vòng/phút ở 37oC, cho đến khi A600nm đạt 0.4-0.6 thì tiến hành cảm ứng bằng IPTG (nồng độ cuối cùng là 0.4 mM). Sinh khối tế bào ở các thời điểm khác nhau 1, 2, 3, 4 giờ và qua đêm (16 giờ) được thu lại bằng ly tâm và được xử lý như đã mô tả ở phần phương pháp để tách riêng các phần cặn và nổi. Protein tổng số thu được ở phần nổi và cặn được kiểm tra bằng điện di SDS-PAGE trên gel polyacrylamide 12.5%. Từ kết quả thu được cho thấy, ở tất cả các điều kiện đã khảo sát, các protein đều được biểu hiện khá ổn định. Không thấy có sự khác biệt cả về động học biểu hiện cũng như về độ tan của chúng, ngay cả ở các điều kiện thay đổi nhiệt độ và tốc độ lắc trong quá trình nuôi cấy vi khuẩn. 6.2. Ái lực của Trichobakin và các dẫn xuất đối với CM- Sepharose Để phục vụ cho tinh chế và những nghiên cứu tiếp theo, quá trình biểu hiện các protein tái tổ hợp nói trên được tiến hành ở 22oC qua đêm (16 giờ). Sau khi biểu hiện, sinh khối tế bào của TBK và các dẫn xuất được thu lại và phá bằng siêu âm trong đệm 50 mM Tris- HCl pH 7.0 có chứa 20 mM EDTA, Triton X-100 0,1%, lysozyme 100 μg/ml. Huyễn dịch tế bào được ly tâm ở 10 000 vòng/phút trong 20 phút, để tách riêng phần cặn và nổi. Phần nổi được nạp thẳng vào cột CM-Sepharose (XK-16/20) trên hệ FPLC (Pharmacia-Biotech) và quy trình tinh chế được tiến hành như đã Chương VI. Thay ₫ổi trình tự amino acid và ái lực của Trichobakin tái tổ hợp … 135 Hình 6.1. Sắc ký đồ tinh chế các protein tái tổ hợp bằng hệ thống FPLC (Pharmacia-Biotech) trên cơ sở cột trao đổi ion CM- Sepharose (Đặng Thành Nam et al, 2003). Phần dịch nổi của các tế bào sau siêu âm và ly tâm được nạp thẳng vào cột CM-Sepharose (XK- 16/20) trên hệ FPLC (Pharmacia-Biotech). Các tạp chất được rửa bằng đệm 50 mM Tris-HCl pH 7.0 cho đến khi A280nm trở lại đường nền. Protein tái tổ hợp được thôi ra khỏi cột bằng gradient nồng độ 0.0-0.4 M NaCl trong đệm 50 mM Tris-HCl pH 7.0 với tốc độ dòng chảy 30 ml/giờ và kích thước mỗi phân đoạn là 1 ml. A. Tách hỗn hợp mini-TBK (I) và PBL-3(II); B. Tinh chế mini-TBK; C: Tinh chế PBL-3. 136 Phan Văn Chi, Nguyễn Bích Nh ...