Thiết lập hệ chuyển gen retrovirut tái tổ hợp biểu hiện IL-12 ở mức độ mARN

Bài viết mô tả chi tiết việc hình thành chủng retrovirut mã hóa IL-12 cấu hình IL-12-p40/linker/ IL-12-p35. Protein được biểu hiện từ tế bào (TB) động vật có vú có hoạt tính cao. Tuy nhiên, việc đưa các đoạn gen mã hóa protein đích vào TB động vật rất phức tạp, làm tăng chi phí biểu hiện và tính chế sau này. Để khắc phục điều này, công nghệ chuyển gen dựa trên khung virut tái tổ hợp đã được triển khai. Bằng cách kết hợp chuyển gen retrovirut với các công nghệ tổng hợp nucleotid và tối ưu hóa codon, chúng tôi đã tạo ra dòng TB bài tiết virut mã hóa IL-12 mRNA.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Thiết lập hệ chuyển gen retrovirut tái tổ hợp biểu hiện IL-12 ở mức độ mARNTẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2014THIẾT LẬP HỆ CHUYỂN GEN RETROVIRUT TÁI TỔ HỢPBIỂU HIỆN IL-12 Ở MỨC ĐỘ mARNNgô Tất Trung*; Lê Hữu Song*; Phan Quốc Hoàn*Hồ Anh Sơn**; Nguyễn Lĩnh Toàn**TÓM TẮTProtein được biểu hiện từ tế bào (TB) động vật có vú có hoạt tính cao. Tuy nhiên, việc đưacác đoạn gen mã hóa protein đích vào TB động vật rất phức tạp, làm tăng chi phí biểu hiện vàtính chế sau này. Để khắc phục điều này, công nghệ chuyển gen dựa trên khung virut tái tổ hợpđã được triển khai. Bằng cách kết hợp chuyển gen retrovirut với các công nghệ tổng hợpnucleotid và tối ưu hóa codon, chúng tôi đã tạo ra dòng TB bài tiết virut mã hóa IL-12 mRNA.* Từ khóa: IL-12; Retrovirut; Protein tái tổ hợp.Construction of Recombinant Retrovirus Plasmid EngineeringSystem for Expression of Interleukin-12 mRNA LevelSummaryRecombinant protein expressed from mammalian cell culture is a good activity. However,the current procedure of delivery target open reading frame into mammalian host is cumbersome,which makes the chimeric protein expension. To overcome the limits of available mammalianexpression systems, many recombinant virus based gene deliver technologies have beenimplemented, in which the retrovirus backbone is one option of choice. In this study, by combiningrecombinant retrovirus plasmid engineering with codon optimization, we have successfullycreated a cell line with significant secreted level of IL-12 mRNA.* Key words: IL-12; Retrovirus; Recombinant protein.ĐẶT VẤN ĐỀInterleukin-12 ban đầu được biết đếnnhư là một cytokine tiÒn viªm, thườngđược tạo ra bởi tÕ bµo Dendritic (DCs) vàthực bµo. Cytokine này có vai trò cảmứng bài tiết interferon-γ (IFN-γ), nhờ đókích thích quá trình biệt hóa hình thànhTB T helper 1 (TH1), đây chính là yếu tốkết nối các phản ứng miễn dịch bẩm sinhvới miễn dịch thích nghi. Sau này, khoahọc đã chứng minh IL-12 đóngvai trò là tác nhân tăng trưởng cho TBgiết tự nhiên (Natural killer cell growthfactor). Cytokine này được hợp thành từhai tiểu phần (subunit) mã hóa bởi haigen khác nhau. Khi các tiểu phần nàyđược dịch mã tạo thành IL-12 p35 và IL12 p40. Hai tiền cytokine này sau khi bàitiết sẽ tiếp tục được sửa đổi sau dịch mãvà lai ghép với nhau, tạo thành phân tửcytokine heterodimer IL-12 p70 với đầyđủ chức năng sinh học cần thiết cho điềuhòa miễn dịch.* Bệnh viện TWQĐ 108** Học viện Quân yNgười phản hồi (Corresponding): Nguyễn Lĩnh Toàn (toannl@vmmu.edu.vn)Ngày nhận bài: 23/05/2014; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 10/09/2014Ngày bài báo được đăng: 02/12/201470TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2014Tác dụng kinh điển mà con người vẫnbiết về IL-12 trong điều trị ung thư đó là: i)kích thích quá trình biệt hóa và định hìnhtính đặc hiệu thụ thể (T cell receptor TCR) trên bề mặt TB lympho T trợ giúp(helper T cell) thông qua kích thích quátrình tăng sinh của TB trình diện khángnguyên Dendritic; ii) định hướng độctính của TB T gây độc (cytotoxic CD8T lymphocyte) [1, 2], iii) ức chế quá trìnhtạo mạch máu: một trong những thay đổicăn bản của TB ung thư so với TB thôngthường cùng mô, đó là liên tục tham giaphân bào, nhu cầu dinh dưỡng cao hơnmức bình thường. Vì thế, chúng tiết racác hormon làm tăng quá trình phát triểncủa mạch máu tới khối u (angiogensis).Cho đến nay, người ta biết rằng IL-12 làmột trong những cytokine ức chế quátrình đó, do đó gián tiếp ức chế phát triểnkhối u [2].Gần đây, một khám phá quan trọngliên quan đến tính chất sinh học của IL-12đó là cytokine này có khả năng ức chếquá trình phát triển của khối u trên môhình động vật thực nghiệm thiếu hụt miễndịch (nude mice) [3]. Trên cơ sở cácnghiên cứu cơ bản, triển khai thử nghiệmlâm sàng sử dụng protein tái tổ hợp IL-12.Tuy nhiên, độc tính của IL-12 rất mạnh,thậm chí gây chết người [4], điều này làmchậm quá trình triển khai ứng dụng IL-12trong điều trị ung thư. Để khắc phục độctính do IL-12 gây nên, một số thử nghiệmkết hợp IL-12 với các cytokine khác nhưIL-2, interferon alpha, B7.1, IL-7, IL-21, IL15 [5], đặc biệt là IL-18. Bằng cách này,độc tính của IL-12 giảm xuống mức gầnnhư không có [6], mang lại triển vọng choứng dụng một trong các interleukine có71tính ức chế ung thư mạnh nhất IL-12 vàothử nghiệm lâm sàng tiếp theo. Vì vậy,công nghệ sản xuất interleukine tái tổ hợpIL-12 không chỉ đem lại lợi ích cho việcphát triển các liệu pháp điều trị ung thưliên quan đến IL-12, mà còn có thể phốikết hợp sử dụng IL-12 với các interleukinetiềm năng khác như: IL-7, IL-15, IL-18,IL-21…Do IL-12 được hợp thành từ hai tiểuphần mã hóa và hai gen khác nhau, việctạo ra p70 với đầy đủ chức năng sinh lýphải được tiến hành trên hệ retrovirut chophép biểu hiện đồng thời cả 2 tiểu phầnp40/p35. Các nghiên cứu thường tạo raIL-12 tái tổ hợp từ 2 ORF mã hóa tươngứng cho 2 tiểu phần p40, p35 nối với nhaubởi một linker peptide, hoặc tạo ra 2 đơnvị mARN độc lập nằm xen kẽ một internalribosome entry site (IRES). Ở phạm vinghiên cứu này, chúng tôi sẽ mô tả chi tiếtviệc hình thành chủng retrovirut mã hóaIL-12 cấu hình IL-12-p40/linker/ IL-12-p35.ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNGPHÁP NGHIÊN CỨU1. Vật liệu nghiên cứu.Dòng TB đóng gói PT-76, humanembryonic kiney - HEK 293T do Nolan lab Standford University phát triển và đượcClone Tech (USA) cung cấp; bộ khungretrovirut plasmid pMXs-IP của TrườngĐại học Toshio Kitamura - Tokyo, phầnmềm Vector NTI và các vật tư sinh họcphân tử khác.2. Phương pháp nghiên cứu.* Hệ retrovirut mã hóa IL-12 cấu hìnhIL-12-p40/linker/IL-12-p35:TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2014Chiến lược thiết kế retrovirut plasmidmang gen ghép IL-12 như sau: đoạn genmã hóa cho các cấu phần p35, p40 củaIL-12 được clon xen kẽ với một đoạnADN mã hóa cho một linker theo thiết kếcủa Mulligan RC [7], chúng tôi bổ sungthêm đoạn ADN mã hóa leader peptideđể đảm bảo protein sẽ được tiết ra môitrường, ...