Thiết lập quy trình định lượng DNA EBV trong máu ngoại vi với độ nhạy cao góp phần sàng lọc phát hiện sớm

Nhóm nghiên cứu đã thiết lập thành công quy trình định lượng DNA EBV trong máu ngoại vi của những bệnh nhân ung thư vòm mũi họng với độ nhạy 96,9%. Đối chiếu với kết quả xét nghiệm trên nhóm chứng là những người khỏe mạnh cho thấy độ đặc hiệu là 98%.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Thiết lập quy trình định lượng DNA EBV trong máu ngoại vi với độ nhạy cao góp phần sàng lọc phát hiện sớmĐẦU VÀ CỔ THIẾT LẬP QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG DNA EBV TRONG MÁU NGOẠI VI VỚI ĐỘ NHẠY CAO GÓP PHẦN SÀNG LỌC PHÁT HIỆN SỚM HỒ HỮU THỌ1, TRIỆU THỊ NGUYỆT1, ĐỖ TRÂM ANH2, NGUYỄN ĐÌNH ỨNG, ĐINH THỊ THU HẰNG3, BÙI TIẾN SỸ4, HOÀNG ĐÀO CHINH5, LÊ MINH KỲ6, VŨ TRƯỜNG PHONG, NGÔ THANH TÙNG7, NGUYỄN KIM LƯU8, NGUYỄN VĂN BA, HỒ ANH SƠN3, HOÀNG VĂN LƯƠNG3, NGHIÊM ĐỨC THUẬN2TÓM TẮT Nhóm nghiên cứu đã thiết lập thành công quy trình định lượng DNA EBV trong máu ngoại vi của nhữngbệnh nhân ung thư vòm mũi họng với độ nhạy 96,9%. Đối chiếu với kết quả xét nghiệm trên nhóm chứng lànhững người khỏe mạnh cho thấy độ đặc hiệu là 98%. Quy trình kỹ thuật định lượng cf-DNA EBV đã đượckiểm định với bộ mẫu chuẩn quốc tế được cung cấp bởi Đại học Hồng Kông. Quy trình được thiết lập trongnghiên cứu góp phần sàng lọc phát hiện sớm bệnh ung thư vòm mũi họng.SUMMARY Development of ultrasensitive q-pcr assay based on circulating EBV DNA for early detection of nasopharyngeal carcinoma In our study, we have establihed successfully an ultrasensitive qPCR assay for detection cf-EBV DNA.Evaluation on clinical samples has proven a remarkably high sensitivity of 96.9% and high specificity of 98%.Moreover, we have also validated the performance of the optimal qPCR assay using the international standardpanel that was provided by Chinese University of Hong Kong.ĐẶT VẤN ĐỀ xác định trong hầu hết các tế bào của khối UTVMH. Triển vọng to lớn của DNA-EBV lưu hành trong máu Ung thư vòm mũi họng (UTVMH) là loại ung thư ngoại vi đối với sàng lọc phát hiện sớm, tiên lượngrất phổ biến ở một số nước Châu Á, trong đó có Việt và đánh giá mức độ đáp ứng điều trị UTVMH đãNam[1,2]. Bệnh nhân UTVMH thường được chẩn được khẳng định qua hàng loạt các nghiên cứu trênđoán ở giai đoạn muộn, đồng thời các triệu chứng thế giới trong hơn 15 năm qua. Tuy nhiên, hiện vẫncủa bệnh thường không đặc hiệu và khó phân biệt chưa có xét nghiệm DNA-EBV chuẩn hóa nào đượcvới các bệnh lý khác ở vùng lân cận. Bên cạnh đó, sử dụng trên lâm sàng. Tại Việt Nam, quy trình địnhUTVMH thường có di căn hạch sớm [3]. Hậu quả là lượng DNA-EBV hiện nay có độ nhạy còn thấp vớinhiều bệnh nhân UTVMH được chẩn đoán ở giai ngưỡng phát hiện là 300 copy/ml huyết tương, nênđoạn tiến triển kèm theo di căn, điều trị khó khăn mà chỉ phát hiện được DNA-EBV trong máu ngoại vi ởhiệu quả không cao. 64%-68% số bệnh nhân UTVMH[4-6]. Thực tế này đặt UTVMH liên quan mật thiết với nhiễm virus ra yêu cầu cần thiết lập quy trình phát hiện địnhEpstein Barr (EBV), hệ gen của virus này đã được lượng DNA-EBV trong máu ngoại vi với độ nhạy cao1 Labo Nghiên cứu Gen, Trung tâm Nghiên cứu Y Dược học Quân sự - Học viện Quân Y2 Khoa Tai-Mũi-Họng - Bệnh viện Quân Y 103 - Học viện Quân Y3 Trung tâm Nghiên cứu Y Dược học Quân sự - Học viện Quân Y4 Khoa Sinh học Phân tử - Bệnh viện Trung Ương Quân Đội 1085 Khoa Xạ phẫu và Xạ trị - Bệnh viện Trung Ương Quân Đội 1086 Trung tâm Ung Bướu và phẫu thuật Đầu cổ - Viện Tai-Mũi-Họng Trung Ương7 Khoa Ung thư Đầu cổ và xạ trị - Bệnh viện K8 Trung tâm Ung Bướu và Y học Hạt nhân - Bệnh viện Quân Y 103 - Học viện Quân Y74 TẠP CHÍ UNG THƯ HỌC VIỆT NAM ĐẦU VÀ CỔở nước ta, góp phần sàng lọc phát hiện các trường Phản ứng PCR được tiến hành trên hệ thốnghợp mắc ung thư vòm mũi họng ở giai đoạn sớm. máy Rotor-Gene Q với thể tích phản ứng là 20µl và 8,6µl dịch chiết DNA được sử dụng làm khuôn. DữVẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU liệu realtime PCR được thu thập bởi hệ thống Rotor-Vật liệu nghiên cứu Gene Q và lưu trong máy tính sau đó sẽ được phân tích bằng phần mềm Rotor-Gene Q. Mỗi mẫu được Mẫu bệnh phẩm lâm sàng: Mẫu máu ngoại vi chạy 02 lần lặp lại, mỗi lần chạy luôn kèm theo cácđược chống đông bằng EDTA của 32 bệnh nhân chứng âm không chứa khuôn DNA. Đường chuẩnđược chẩn đoán xác định UTVMH dựa vào kết quả được thiết lập sử dụng mẫu chuẩn DNA quốc tế củagiải phẫu bệnh của sinh thiết vòm mũi họng (nhóm Đại học Hồng Kông với dãy nồng độ xác định. Giá trịbệnh). Mẫu máu ngoại vi được chống đông bằng trung bình kết quả định lượng của 02 lần lặp lạiEDTA của 105 người khỏe mạnh (nhóm chứng). được sử dụng để tính toán nồng độ. Các hóa chất dùng trong tách chiết DNA từ Phương pháp xử lý số liệuhuyết tương bao gồm bộ Kit tách chiết AnapureDNA/RNA Viral Mini Kit, Isopropanol, Ethanol 100%. Nồng độ của DNA-EBV huyết tương được tínhHóa chất dùng trong phản ứng Realtime PCR như: theo đơn vị số copy/ml huyết tương.Quantitect Probe master mix, Quantitect SYBR KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬNmaster mix, Primer, Probe, DMSO. Kết quả tối ưu quy trình realtime PCR phát hiện Panel mẫu chuẩn định lượng DNA của EBV với DNA-EBV.giải nồng độ xác định và mẫu huyết tương chuẩndương tính với DNA-EBV của Đại học Hồng Kông, Tiế ...