Thu nhận kháng thể IgY có ái lực cao với độc tố vi nấm fumonisin sử dụng trong chẩn đoán miễn dịch

Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm tạo kháng thể có ái lực cao với fumonisin B1 và B2 (FB1 và FB2), làm nguyên liệu khởi đầu cho phương pháp miễn dịch phát hiện nhanh các độc tố trên. Vật liệu và phương pháp: độc tố FB1 được gắn với Keyhole limpet hemocyanin (KLH) tạo thành phức hợp FB1-KLH để gây miễn dịch cho gà mái.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Thu nhận kháng thể IgY có ái lực cao với độc tố vi nấm fumonisin sử dụng trong chẩn đoán miễn dịchTẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2016THU NHẬN KHÁNG THỂ IgY CÓ ÁI LỰC CAO VỚI ĐỘC TỐVI NẤM FUMONISIN SỬ DỤNG TRONG CHẨN ĐOÁN MIỄN DỊCHĐỗ Như Bình*; Trần Thị Huyền Trang**Tạ Mai Trang**; Lê Quang Hòa**TÓM TẮTMục tiêu: tạo kháng thể có ái lực cao với fumonisin B1 và B2 (FB1 và FB2), làm nguyên liệukhởi đầu cho phương pháp miễn dịch phát hiện nhanh các độc tố trên. Vật liệu và phương pháp:độc tố FB1 được gắn với Keyhole limpet hemocyanin (KLH) tạo thành phức hợp FB1-KLH để gâymiễn dịch cho gà mái. Kháng thể IgY tạo ra được tách chiết, tinh sạch và kiểm tra độ đặc hiệu vớiFB1 và FB2 thông qua phản ứng ELISA cạnh tranh gián tiếp. Kết quả: thời điểm thu trứng tốt nhấttừ 9 - 14 ngày sau lần tiêm cuối cùng và quy trình tinh sạch cho chế phẩm IgY có độ tinh sạchcao. Giá trị IC50 của FB1 và FB2 đối với chế phẩm IgY trong phản ứng ELISA cạnh tranh xác địnhđược lần lượt là 10 và 49 ng/ml. Kết luận: chế phẩm IgY được tạo ra trong nghiên cứu có khảnăng sử dụng làm nguyên liệu cho sản xuất bộ kit nhanh phát hiện nhanh FB.* Từ khoá: Fumonisin; Kháng thể lòng đỏ trứng (IgY); ELISA.Obtaining High Affinity IgY Against Fumonisin with Potential Usein ImmunodiagnosticSummaryObjectives: To produce high affinity antibody against fumonisin (FB) FB1 and FB2, that can beused as materials for some immunologic methods in detection of toxin. Materials and methods: FB1Keyhole limpet hemocyanin (KLH) conjugate was made to generate immunogenicity in hen. Yolkimmunoglobulin (IgY) antibody was purified by extraction and tested the specificity against FB1, FB2by indirect competitive ELISA. Results: The best time for egg collection was 9 - 14 days after the lastimmunisation and the extraction protocol obtains high purity IgY antibody. The IC50 value of IgYagainst FB1 and FB2 in the indirect competitive ELISA were 10 and 49 ng/ml, respectively.Conclusion: IgY can be used as materials for developing rapid test kit to detect FB.* Key words: Fumonisin; Yolk immunoglobulin (IgY); ELISA.ĐẶT VẤN ĐỀĐộc tố fumonisin nhóm B (FB), thườngtồn tại trong ngô cũng như các thực phẩmcó nguồn gốc từ ngô, được sản sinh từchủng nấm Fusarium moniliforme [1].Trong đó, FB1 và FB2 được coi là hai độctố phổ biến, có độc tính cao nhất trongnhóm fumonisin, gây nhiều bệnh ở ngườivà động vật như chứng nhũn não ở ngựa,chứng phù phổi ở lợn, có độc tính đối vớigan thận ở nhiều loài khác và ung thưthực quản ở người [5, 7].* Học viện Quân y** Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩmNgười phản hồi (Corresponding): Đỗ Như Bình (binhvef2006@gmail.com)Ngày nhận bài: 10/04/2016; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 25/05/2016Ngày bài báo được đăng: 27/05/201629TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2016Hiện nay, phương pháp chuẩn để pháthiện và định lượng FB1, FB2 trong cácmẫu thực phẩm đều dựa trên kỹ thuật sắcký lỏng hiệu năng cao (HPLC), phươngpháp này yêu cầu cao về thiết bị cũngnhư trình độ kỹ thuật viên, do vậy khôngthích hợp với các phép phân tích sàng lọctại hiện trường. Gần đây, nhờ ứng dụngkỹ thuật sắc ký miễn dịch dưới dạng quethử với hợp phần quan trọng nhất trongque thử phát hiện FB là kháng thể [4] việcphát hiện độc tố vi nấm nói chung và FBnói riêng đã được đơn giản hóa. Mục tiêucủa nghiên cứu: Sản xuất kháng thể IgYkháng FB1 bằng cách gây đáp ứng miễndịch ở gà. IgY được vận chuyển qua lòngđỏ trứng, do vậy có thể tinh sạch với sốlượng lớn từ trứng gà bằng phương phápkết tủa đơn giản, chi phí thấp [2, 3].các cầu nối glutaraldehyde dư chưa gắnđược với FB1 sẽ cho tác dụng với 6,5 mgL-lysine (Sigma) với điều kiện có khuấytrong 4 giờ ở nhiệt độ phòng. Sau quátrình thẩm tích loại FB1 tự do, sản phẩmcuối cùng tạo ra là cộng hợp KLH-FB1.Cộng hợp BSA-FB1 được chế tạo để làmđối chứng dương cho quy trình.VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁPNGHIÊN CỨU02 gà mái đang thời kỳ đẻ trứng đượctiêm gây đáp ứng miễn dịch với liều0,2 mg cộng hợp KLH-FB1 trong tổng thểtích 1 ml chứa 50% tá chất FCA (Freund’scomplete adjuvant) ở ngày đầu tiên. Sau10 ngày (ngày thứ 10), tiêm nhắc lại gàlần thứ nhất với liều 0,1 mg cộng hợpKLH-FB1 trong tổng thể tích 1 ml chứa50% tá chất FIA (Freund’s incompleteadjuvant). 10 ngày tiếp theo (ngày thứ20), tiêm nhắc lại gà lần thứ hai với liềulượng tương tự như lần tiêm nhắc lại thứnhất. Trứng gà không tiêm cũng nhưtrứng gà tiêm KLH-FB1 ở các thời điểmsau khi tiêm thu lại để tinh sạch kháng thểIgY nhằm kiểm tra bằng kỹ thuật ELISA.1. Vật liệu nghiên cứu.Gà siêu trứng Ai Cập, số lượng 03 condo Trang trại Gà giống Thụy Phương(Long Biên, Hà Nội) cung cấp. Hóa chấtsử dụng gồm: độc tố FB1 (Santa CruzBiotechnology), FB2 (Sigma), kháng thểchuột đơn dòng kháng FB1 (Biotez), cáccộng hợp phát hiện gắn HRP kháng KLH(Gallus Immunotech) và kháng IgY (SantaCruz Biotechnology) cùng những hóachất khác (Hãng Thermo Scientific, Sigmavà Promega).2 ...