Tiểu luận kỹ thuật gen

Kỹ thuật gen gồm nhều giai đoạn nhằm biến đổi cấu trúc gen, tạo gen mới, đưa các gen tái tổ hợp vào tế bào chủ để thu nhận các prôtêin tái tổ hợp, hoặc nghiên cứu cấu trúc bộ gen, lập bản đồ gen.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Tiểu luận kỹ thuật genChuyên công ngh sinh h c ---------------------------------------------------Ph m Vi t Hà Cao H c K18II . NGUYÊN LÍ K THU T GEN1. Các bư c ch y u c a k thu t gen K thu t gen g m nh u giai o n nh m bi n i c u trúc gen, t o gen m i, ưa các gentái t h p vào t bào ch thu nh n các prôtêin tái t h p, ho c nghiên c u c u trúc b gen, gen. K thu t gen g m các bư c cơ b n sau:l pb na. Chu n b gen c n tách dòng Gen c n tách dòng ( o n ADN insert), có th ư c chu n b b ng phương pháp táchchi t (ADN, ARN) t sinh v t mang ngu n gen t nhiên ho c t ng h p nhân t o. Tách chi t (ADN, ARN) t sinh v t mang ngu n gen t nhiên; tách chi t plasmid t vikhu n. Tinh s ch và ch n l c thu ư c các gen c n tách dòng. S d ng k thu t nhân genPCR nhân gen c n thi t lên m t s lư ng l n các b n sao, m b o m t lư ng ADN (ARN)c n thi t. T ng h p o n ADN nhân t o trên cơ s ã bi t các trình t c hi u ( ho c trình taxitamin trong chu i polipeppit). Dùng k thu t t ng h p nhân t o o n oligonuclêotit m ch ơn và nhân gen PCR t o s lư ng các o n ADN nhân t o l n.b. T o vectơ tái t h p D a vào c i m c a gen c n tách dòng l a ch n lo i vectơ và enzim gi i h n phùh p. G m + C t ADN c a t bào cho ch a gen c n chuy n và ADN c a plasmid cùng m t lo ienzim c t gi i h n, enzim này s c t hai m ch ơn c a phân t ADN v trí nuclêôtit xác nh(trình t nh n bi t) t o ra các u dính có trình t nuclêôtit b sung. + Tr n ADN c a t bào cho v i ADN plasmid ã c t h , các u dính b t c p b sungv i nhau nh enzim n i ligaza t o liên k t photpho ieste làm li n m ch ADN. Plasmid manggen l g i là ADN tái t h p. Hình . Sơ các bư c ch y u c a k thu t gen-------------------------------------------------- Trang 1 ----------------------------------------------------------Chuyên công ngh sinh h c ---------------------------------------------------Ph m Vi t Hà Cao H c K18c. Bi n n p vectơ tái t h p vào t bào ch S d ng các phương pháp bi n n p khác nhau ( s c nhi t, xung i n, b n gen…) ưacác vectơ tái t h p vào t bào ch . T o môi trư ng thích h p vectơ tái t h p t n t i và ư c nhân lên cùng t bào ch .d. Sàng l c các dòng t bào mang vectơ tái t h p Sàng l c dòng tái t h p là quá trình ki m tra ch n l c và tách riêng các dòng tái t h pcó ho t tính.e. Nuôi c y t bào tái t h p thu s n ph m t bào tái t h p ư c nuôi trong các bình lên men, v i i u ki n thích h p v dinhdư ng, nhi t , pH… các t bào tăng sinh kh i nhanh, t o các s n ph m prôtêin tái th p m c cao nh t. Th c hi n công ngh tách chi t prôtêin tái t h p, tinh s ch thu chph m.2. Nguyên t c ch n vectơ tách dòng Ch n vectơ tách dòng thích h p có vai trò quy t nh s thành công trong tách dòng m b o tách dònh gen thành công, khi ch n vectơ tách dòng c n chú ý nguyên t cgen.sau: +D a vào kích thư c và b n ch t o n ADN c n tách dòng làm căn c ch n vectơ. - N u ADN cài có ngu n g c t gen cu sinh v t nhân sơ vectơ tách dòng có th ch n là plasmid, phage, cosmid… - N u ADN cài có ngu n g c t gen cu sinh v t nhân th c vectơ tách dòng có th ch n là, phage, nhi m s th nhân t o n m men… + S tương ng các v trí c hi u c a các enzim gi i h n gi a o n cài ADN và vectơ tách dòng. Nghĩa là, o n cài ADN và vectơ tách dòng ph i có các v trí c t c hi u c a cùng m t lo i enzim gi i h n. + Vectơ tách dòng ph i thích h p v i lo i t bào ch , có kh năng tái b n trong t bào ch , t o s lư ng b n sao l n ( 50b n/1t bào), nhưng không gây nh hư ng n ho t ng c a t bào ch . +Gen ch th trong vectơ tách dòng càng d nh n bi t càng t t d dàng ch n l c các vectơ tái t h p. Các i m c t c a enzim gi i h n thư ng n m trong các gen ch th , giúp cho s nh n bi t và sàng l c d dàng. + Vectơ tách dòng ph i có hi u qu tách dòng cao, t o nên t l vectơ tái t h p cao.3. Nguyên t c t o vectơ tái t h p T o vectơ tái t h p là th c hi n k thu t g n n i gen c n tách dòng vào vectơ táchdòng. T o vectơ tái t h p th c hi n theo các bư c sau : + Chu n b nguyên li u : Gen c n tách dòng (ADN insert) tinh s ch c n ư c nhân lênb ng PCR ( 20- 25 chu kỳ) t o m t hàm lư ng c n thi t s n ph m PCR. Vectơ tách dòng thíchh p nhw pBR 322, pUC 18… + Th c hi n ph n ng n i gen c n tách dòng v i vectơ : chu n b thành ph n ph n ngphù h p v i m i lo i vectơ tách dòng. Ví d : vectơ tách dòng là pUC 18 h n h p ph n ng g m : 1,0 µl m ph n ng ;0,5µl ATP 10 mM ; 1,0 µl enzym T4 ADN ligase ; 1,0 µl vectơpUC 18 ; 5,0 µl s n ph mPCR tách dòng ; 1,5 µl H2O.-------------------------------------------------- Trang 2 ----------------------------------------------------------Chuyên công ngh sinh h c ---------------------------------------------------Ph m Vi t Hà Cao H c K ...