Tinh sạch Peptid người tái tổ hợp có khả năng thấm qua màng, khả năng ứng dụng trong protein trị liệu

Bài viết Tinh sạch Peptid người tái tổ hợp có khả năng thấm qua màng, khả năng ứng dụng trong protein trị liệu trình bày những khiếm khuyết của protein là nguyên nhân của phần lớn các bệnh ở người. Protein trị liệu là liệu pháp thay thế có hiệu quả cho phần lớn các bệnh liên quan tới quá trình tổng hợp sai protein hoặc ức chế tiến trình biệt hóa sai của tế bào ung thư,... Mời các bạn cùng tham khảo.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Tinh sạch Peptid người tái tổ hợp có khả năng thấm qua màng, khả năng ứng dụng trong protein trị liệuTẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌCTINH SẠCH PEPTID NGƯỜI TÁI TỔ HỢP CÓ KHẢ NĂNG THẤMQUA MÀNG, KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG TRONG PROTEIN TRỊ LIỆUNguyễn Văn HạnhViện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn Lâm KH - CN Việt NamNhững khiếm khuyết của protein là nguyên nhân của phần lớn các bệnh ở người. Protein trị liệu là liệupháp thay thế có hiệu quả cho phần lớn các bệnh liên quan tới quá trình tổng hợp sai protein hoặc ức chếtiến trình biệt hóa sai của tế bào ung thư. Trong nghiên cứu này, chúng tôi trình bày kết quả tổng hợp cácpeptid có khả năng thấm qua màng tế bào (CPP) từ bộ gen người nhằm cung cấp công cụ mới tạo cácprotein tái tổ hợp có thể xuyên màng để ứng dụng trong sinh học và y học. Hai CPP mới được chọn từ vùngchuyển tín hiệu vào nhân của tác nhân phiên mã ở người. Chúng được thử chức năng vận chuyển vào tếbào Hela và Jurkat trong điều kiện in vitro. Kết quả cho thấy, những protein mới có hiệu quả vận chuyểntương tự đối TAT-EGFP mặc dù chúng có trình tự acid amin ngắn hơn. Các protein đi vào tế bào chất vànhân, từ đó giả thiết rằng các protein liên quan nội bào có thể ứng dụng cho mục đích trị liệu.Từ khóa: CPP, protein tái tổ hợp, protein trị liệu, TATI. ĐẶT VẤN ĐỀHướng quan trọng nhất của liệu phápprotein là tạo các protein có chức năng ngănchặn sự kích hoạt các gen dẫn đến phát triểntế bào ung thư. Ngoài ra, protein cũng đượcđịnh hướng để kích hoạt các gen sản xuấtcác sản phẩm cần thiết như insulin hay làmtác nhân đáp ứng trong các bệnh nhân thiếuhụt miễn dịch [1]. Hiện đã có một số thuốc làprotein hay có nguồn gốc từ các protein đãđược thương mại hóa và có mặt trên thịtrường. Theo thông báo gần đây trongnghiên cứu “phân tích thị trường protein trịliệu toàn cầu”, thị trường này dự báo sẽ tăngtrung bình 13% trong giai đoạn 2012 - 2014.Thông báo này cũng tiết lộ lĩnh vực kháng thểđơn dòng sẽ chiếm ưu thế nhất trong các loạithuốc. Ttuy nhiên các thuốc trong lĩnh vựcprotein cũng hứa hẹn tạo ra thị trường nhiều tỉđô la [2].Địa chỉ liên hệ: Nguyễn Văn Hạnh - Viện Công nghệ Sinhhọc - 18 Hoàng Quốc Việt - Hà Nội.Email: nvhanh@ibt.ac.vnNgày nhận: 27/11/2012Ngày được chấp thuận: 26/4/20138Các peptid có khả năng thấm qua màng tếbào (cell permeable peptides - CPP) bao gồmmột nhóm các peptid có khả năng thấm quamàng sinh chất của tế bào sống [3]. Cácnghiên cứu phát triển CPP được tiến hànhsau khám phá ra cơ chế truyền nhiễm của HIVkhi chúng dựa vào protein TAT để thâm nhậpvào tế bào người [4]. Dựa vào phát hiện này,các CPP mới đã được phát triển là các peptidcó chiều dài 10 - 14 acid amin, giàu arginin vàleucin ở các loài sinh vật hay được tổng hợpnhân tạo [5]. Đánh giá chức năng của nhữngCPP này thường dựa vào khả năng vậnchuyển protein từ môi trường ngoài vào trongtế bào. Tuy nhiên, các peptid ngoài việc chúngcó chức năng vận chuyển protein qua màng,chúng cũng là các yếu tố ngoại sinh nênthường gây độc cho các tế bào người. Dovây, để tăng khả năng ứng dụng trong y họcdo tránh được tính độc hại của các peoteinngoại lai, những peptid có nguồn gốc gần gũihoặc tổng hợp từ DNA người sẽ là công cụ tốtđể phát triển các thuốc theo định hướngprotein trị liệu [6].TCNCYH 82 (2) - 2013TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌCTrong nghiên cứu này, nhằm mục tiêu thửnghiệm khả năng vận chuyển protein của cácpeptid có nguồn gốc từ các đoạn gen chuyểntín hiệu vào nhân tế bào (nuclear locallingsignal) ở người thay thế cho các peptid cónguốc gốc từ virus hay các vi sinh vật khác đểứng dụng tạo protein trị liệu trong tương lai.II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP1. Chuẩn bị protein tái tổ hợpProtein EGFP tái tổ hợp được tổng hợp vàtinh sạch theo phương pháp của Choi và cộngsự [7]. Trình tự DNA của TAT và các CPPkhác được nhân lên cùng với gen EGFP (hình1) trong vector pET28a(+), biểu hiện trongE. coli BL21 (hình 2).Hình 1. Sơ đồ cấu tạo thành phần cácprotein trong nghiên cứuProtein được hoạt hóa tổng hợp bằngIPTG (500 µM), tinh sạch bằng phương phápsử dụng cột Niken (Qiagen) gắn kết với đuôi 6Histidin trong vector pET28a (+). Sau khi tinhsạch, protein được khử muối bằng cột PD10(Qiagen), trong môi trường PBS 20% glycerol.Protein được định lượng, chia nhỏ và bảoquản ở -20oC cho tới khi sử dụng.2. Đánh giá khả năng vận chuyển protein trên tế bào JurketPhương pháp thử nghiệm chức năngxuyên màng của protein được thực hiện theoGomez và cộng sự [3]. Tế bào lympho T (tếbào Jurkat, RIKEN) được nuôi trong môitrường RPMI-1640 có bổ sung 10% FBS, 50IU/ml penicillin và 50 µg/ml streptomycin. Thutoàn bộ tế bào sau 2 ngày nuôi, ly tâm 3000v/p, gieo tế bào theo nồng độ 1,5 triệu tế bàovào mỗi đĩa nuôi 6 giếng. Protein thử nghiệmđược bổ sung vào các đĩa nuôi đạt nồng độ5 mM. Nuôi tế bào trong vòng 1 giờ ở 37oC,độ ẩm bão hòa, 5% CO2. Thu mẫu tế bào đãxử lý, rửa 2 lần bằng PBS trước khi đo độphát xạ huỳnh quang bằng máy FACS(Beckman Coulter, ...