Tinh sạch protein (p-3)

Phân tách protein bằng điện di trên gel Để đánh giá quá trình tinh sạch protein có hiệu quả hay không, ngoài cách xác định hoạt tính đặc trưng của protein có tăng lên sau mỗi bước tinh sạch, còn một cách là làm hiện hình các protein hiện diện trong mẫu sau mỗi bước; điều này được thực hiện nhờ kỹ thuật điện di.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Tinh sạch protein (p-3) Tinh sạch protein (p-3)Phân tách protein bằng điện ditrên gelĐể đánh giá quá trình tinh sạchprotein có hiệu quả hay không,ngoài cách xác định hoạt tính đặctrưng của protein có tăng lên saumỗi bước tinh sạch, còn một cáchlà làm hiện hình các protein hiệndiện trong mẫu sau mỗi bước; điềunày được thực hiện nhờ kỹ thuậtđiện di.1 Điện di một chiềuMột phân tử có mang điện tích sẽdi chuyển trong điện trường. Hiệntượng này, được đặt tên là điện di,giúp hướng tới một kỹ thuật rấtmạnh để phân tách protein và cácđại phân tử khác như DNA vàRNA. Vận tốc di chuyển (v) củamột protein (hay bất kỳ phân tửnào) trong điện trường phụ thuộcvào lực điện trường (E), điện tíchthực của protein (z) và hệ số ma sát(f)Lực điện Ez kéo phân tử mang điệntích tới điện cực trái dấu bị cản trởbởi lực kéo của độ nhớt fv tăng lêndo sự ma sát giữa phân tử đangchuyển động với môi trường. Lựcma sát phụ thuộc vào cả khốilượng, hình dạng của phân tử đangdi chuyển lẫn độ nhớt (η) của môitrường. Với một khối cầu có bánkính là r, ta cóĐiện di luôn được thực hiện trêngel (hay trên vật thể rắn như giấy)bởi vì gel giống như một cái rayphân tử sẽ làm tăng sự phân tách.Những phân tử nhỏ hơn kích thướclỗ gel sẽ có thể di chuyển xuyênqua gel, trong khi đó những phân tửlớn hơn lỗ gel thì gần như không dichuyển. Những phân tử có kíchthước trung bình di chuyển tronggel với nhiều vận tốc khác nhau.điện di được thực hiện trên mộtbảng polyacrylamide mỏng, thẳngđứng. Hướng của dòng điện từ trênxuống.Gel polyacrylamide, được tạo thànhtừ sự polymer hóa acrylamide và sựliên kết chéo củamethylenebisacrylamide, đượcchọn làm môi trường cho điện di vìnó có tính trơ về mặt hóa học vàđược tạo hình nhanh chóng. Điện dilà một cách lọc qua gel mà theo đótất cả các phân tử, không xét vềkích thước, sẽ bị tác động một lựcđể di chuyển trong cùng một chấtnền. Gel ở đây có thể xem tươngđương với một hạt trong cột lọcgel.Các protein có thể được phân táchdựa trên khối lượng bằng điện ditrên acrylamide dưới điều kiện đãbị biến tính. Hỗn hợp protein đượchòa tan trong dung dịch sodiumdodecyl sulfate (SDS), một chất tẩymang điện tích âm sẽ phá tất cả cácnối không cộng hóa trị của proteinban đầu. Mercaptoethanol (2-thioethanol) hay dithiothreitol cũngcó thể được thêm vào để làm giảmsố nối disulfide. Phức hợp SDS vớiprotein đã bị biến tính có một điệntích thực âm tỉ lệ thuận với khốilượng của protein. Điện tích âm cóđược do gắn với SDS lớn hơn rấtnhiều điện tích của bản thân proteinban đầu; vì thế, điện tích ban đầucủa protein không ảnh hưởng đángkể đến điện tích của phức hợp.Phức hợp SDS-protein sau đó sẽ làmẫu để chạy điện di. Khi điện dikết thúc, những protein trên gel sẽđược nhìn thấy là một dãy các băngbằng cách nhuộm với bạc hay mộtchất nhuộm màu như Coomassieblue. Những đánh dấu phóng xạ cóthể được phát hiện bằng cách đặtmột tấm phim chụp x quang lênmiếng gel, quá trình này gọi làphóng xạ tự ghi.Những protein nhỏ di chuyểnnhanh trong gel, trong khi nhữngprotein lớn ở phía đầu, gần vị trínạp mẫu. Tính di động của phầnlớn các chuỗi polypeptide dướinhững điều kiện như thế tỉ lệ vớikhối lượng của chúng. Tuy nhiên,cũng có vài protein giàucarbohydrate và protein màngkhông tuân theo mối tương quannày. SDS-PAGE có độ phân táchcao, cho kết quả nhanh và độ nhạycao. Chỉ với lượng nhỏ khoảng0.1ug (~2pmol) protein đã cho vạchrất rõ khi nhuộm với Coomassieblue và thậm chí ít hơn (~0.02ug)vẫn có thể được phát hiện khinhuộm bằng bạc. Những proteinchênh lệch về khối lượng khoảng2% (ví dụ: 40 kD và 41 kD haykhác nhau khoảng 10 acid amin) cóthể phân biệt được bằng SDS-PAGE.Vì vậy, SDS-PAGE giúp chúng tađánh giá kết quả của quá trình tinhsạch. Với những phân đoạn đầutiên, kết quả là dãy gồm rất nhiềuprotein. Nhưng qua mỗi bước tinhsạch, số lượng protein sẽ giảm vàsẽ có một băng ngày càng đậm.Vạch đó tương ứng với protein mụctiêu.2 Điện di dựa vào điểm đẳng điệnCác protein còn có thể được phântách bằng điện dựa vào tỉ lệ giữa sốacid amin có tính acid và số acidamin có tính base của chúng. Điểmđẳng điện của một protein (pI) làđiểm pH mà ở đó điện tích thực củanó bằng 0. Tại điểm pH này, tính diđộng của protein trong điện trườngcũng bằng 0 bởi vì z trong côngthức (1) bằng 0. Mỗi một protein cómột pI riêng; ví dụ như pI củacytochrome C, một protein vậnchuyển ion có tính base cao, là10.6, trong khi pI của albuminhuyết thanh, một protein có tínhacid trong máu, là 4.8. Giả định chomột hỗn hợp protein chạy trongđiện trường trong một miếng gelvới một khuynh độ pH, không cósự hiện diện của SDS. Mỗi proteinsẽ di chuyển cho đến khi nó đến vịtrí mà tại đó pH bằng pI của nó.Dựa vào hiện tượng này, ta cóphương pháp phân tách protein dựavào điểm đẳng điện của protein. đểtạo Khuynh độ pH, trước hết là chovào gel một hỗn hợppolyampholyte (những polymernhỏ đa điện tích) có nhiều giá trị ...