Tinh sạch PROTEIN (Phần 1)

Tham khảo tài liệu tinh sạch protein (phần 1), tài liệu phổ thông, sinh học phục vụ nhu cầu học tập, nghiên cứu và làm việc hiệu quả
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Tinh sạch PROTEIN (Phần 1) Tinh sạch PROTEIN (Phần 1)I- Giới thiệu chung Sự tinh sạch của protein rất quantrọng vì từ protein tinh sạch chúngta có thể xác định được trình tựacid amin, mối liên hệ về tiến hóagiữa các protein trong những cá thểkhác nhau và khảo sát các chứcnăng sinh hóa của các protein đó.Hơn thế nữa, việc tinh thể hóaprotein chỉ có thể thực hiện vớinhững protein tinh sạch và từnhững tinh thể đó chúng ta sẽ biếtđược cấu trúc bậc 4 cũng như cácđơn vị chức năng của protein thôngqua dữ liệu chiếu xạ tia X. Vì vậy, quá trình tinh sạchprotein không ngừng được cải tiếnđể đạt được độ tinh sạch cao nhấtnhưng nhìn chung một quá trìnhtinh sạch protein cũng cần đi quacác bước căn bản sau: 1. Nhận biết protein mục tiêu 2. Ly trích protein từ tế bào 3. Thu nhận protein mục tiêudựa trên độ hoà tan, kích thước,điện tích, và liên kết ái lực 4. Phân tách protein bằng điệndi trên gel 5. Xác định trọng lượng và khốilượng của proteinII. Nhận biết protein mục tiêu Kết quả của sự tinh sạch là mộtmẫu protein chỉ chứa đúng một loạiphân tử, ở đây là một loại proteinmà nhà sinh hóa quan tâm. Mẫuprotein này chỉ là một phân đoạnchiếm 1% vật liệu ban đầu, vốn cóthể là dịch nuôi cấy tế bào hay mộtcơ quan riêng biệt lấy của thực vậthay động vật. Để xác định đượcprotein mục tiêu từ hỗn hợpprotein, nhà sinh hóa cần thực hiệnmột thử nghiệm dựa vào đặc tínhcủa protein đó. Nếu protein mụctiêu là một enzyme thì thử nghiệmsẽ được thực hiện dựa trên hoạttính của enzyme đó. Cụ thể như vớienzyme lactate dehydrogenase, mộtenzyme có vai trò trong việc sảnxuất năng lượng từ glucose cũngnhư tổng hợp glucose từ lactate, đểxác định enzyme này thì dựa trênphản ứng của nó trong tế bào. Sau đó, dựa vào khả năng hấpthụ ánh sáng mạnh ở bước sóng340nm của Nicotinamide adeninedinucleotide (NADH), ta có thể đođược lượng ánh sáng được hấp thụở bước sóng 340nm trong một đơnvị thời gian để xác định hoạt tínhcủa enzyme lactate dehydrogenase.Trên thực tế việc tìm ra một thửnghiệm hiệu quả thường rất khó,nhưng nếu có được một cách thửnghiệm càng đặc hiệu thì quá trìnhtinh sạch càng hiệu quả. Tuy nhiên,để chắc chắn quá trình tinh sạchhoạt động tốt, chúng ta còn cần mộtthông số là lượng protein có tronghỗn hợp được thử nghiệm. Hiệnnay có rất nhiều phương pháp pháthiện nhanh và chính xác nồng độprotein. Dựa vào 2 thông số thựcnghiệm là hoạt tính enzyme vànồng độ protein, ta có thể xác địnhhoạt tính riêng của enzyme tức là tỉlệ hoạt tính enzyme với hàm lượngprotein có trong mẫu thử nghiệm.Hoạt tính riêng càng cao thì quátrình tinh sạch càng hiệu quả haynói cách khác, mục tiêu của việctinh sạch là làm tăng tối đa hoạttính riêng.III. Ly trích protein từ tế bào Khi đã tìm ra thử nghiệm phùhợp và chọn được nguồn protein,chúng ta cần phân đoạn dịch tế bàothành nhiều phần và xác định xemphần nào chứa nhiều protein mụctiêu. Quá trình tìm phân đoạn mụctiêu được phát triển bằng sự màymò qua từng thí nghiệm. Bước đầutiên là phá vỡ màng tế bào, tạothành hỗn hợp đồng chất. Sau đóphân đoạn hỗn hợp bằng ly tâm,dịch nổi chứa phân tử có trọnglượng thấp, những phân tử có trọnglượng cao hơn lắng xuống đáy ốngly tâm. Dịch nổi lại được ly tâm lầnnữa với lực mạnh hơn để tạo cặn vàdịch nổi mới. Tiến trình này, đượcgọi là ly tâm phân đoạn, sẽ tạođược nhiều phân đoạn khác nhauvới tỉ trọng giảm dần, mỗi phânđoạn này chứa hàng trăm phân tửprotein khác nhau, sẽ được tinhsạch sau khi đã qua thử nghiệmhoạt tính. Thông thường, một phânđoạn có hoạt tính cao sẽ là nguồnvật liệu cho các kỹ thuật tinh sạchhiệu quả.