Kiến thức về Tinh sạch protein

Sự tinh sạch của protein rất quan trọng vì từ protein tinh sạch chúng ta có thể xác định được trình tự acid amin, mối liên hệ về tiến hóa giữa các protein trong những cá thể khác nhau và khảo sát các chức năng sinh hóa của các protein đó. Hơn thế nữa, việc tinh thể hóa protein chỉ có thể thực hiện với những protein tinh sạch và từ những tinh thể đó chúng ta sẽ biết được cấu trúc bậc 4 cũng như các đơn vị chức năng của protein thông qua dữ liệu chiếu...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Kiến thức về Tinh sạch protein Tinh sạch proteinI. Giới thiệu chungSự tinh sạch của protein rất quan trọng vì từ protein tinh sạch chúng ta có thểxác định được trình tự acid amin, mối liên hệ về tiến hóa giữa các proteintrong những cá thể khác nhau và khảo sát các chức năng sinh hóa của cácprotein đó. Hơn thế nữa, việc tinh thể hóa protein chỉ có thể thực hiện vớinhững protein tinh sạch và từ những tinh thể đó chúng ta sẽ biết được cấutrúc bậc 4 cũng như các đơn vị chức năng của protein thông qua dữ liệu chiếuxạ tia X.Vì vậy, quá trình tinh sạch protein không ngừng được cải tiến để đạt được độtinh sạch cao nhất nhưng nhìn chung một quá trình tinh sạch protein cũng cầnđi qua các bước căn bản sau:1. Nhận biết protein mục tiêu2. Ly trích protein từ tế bào3. Thu nhận protein mục tiêu dựa trên độ hoà tan, kích thước, điện tích, vàliên kết ái lực4. Phân tách protein bằng điện di trên gel5. Xác định trọng lượng và khối lượng của proteinII. Nhận biết protein mục tiêuKết quả của sự tinh sạch là một mẫu protein chỉ chứa đúng một loại phân tử,ở đây là một loại protein mà nhà sinh hóa quan tâm. Mẫu protein này chỉ làmột phân đoạn chiếm 1% vật liệu ban đầu, vốn có thể là dịch nuôi cấy tế bàohay một cơ quan riêng biệt lấy của thực vật hay động vật. Để xác định đượcprotein mục tiêu từ hỗn hợp protein, nhà sinh hóa cần thực hiện một thửnghiệm dựa vào đặc tính của protein đó. Nếu protein mục tiêu là một enzymethì thử nghiệm sẽ được thực hiện dựa trên hoạt tính của enzyme đó. Cụ thểnhư với enzyme lactate dehydrogenase, một enzyme có vai trò trong việc sảnxuất năng lượng từ glucose cũng như tổng hợp glucose từ lactate, để xác địnhenzyme này thì dựa trên phản ứng của nó trong tế bàoSau đó, dựa vào khả năng hấp thụ ánh sáng mạnh ở bước sóng 340nm củaNicotinamide adenine dinucleotide (NADH), ta có thể đo được lượng ánhsáng được hấp thụ ở bước sóng 340nm trong một đơn vị thời gian để xác địnhhoạt tính của enzyme lactate dehydrogenase. Trên thực tế việc tìm ra một thửnghiệm hiệu quả thường rất khó, nhưng nếu có được một cách thử nghiệmcàng đặc hiệu thì quá trình tinh sạch càng hiệu quả. Tuy nhiên, để chắc chắnquá trình tinh sạch hoạt động tốt, chúng ta còn cần một thông số là lượngprotein có trong hỗn hợp được thử nghiệm. Hiện nay có rất nhiều phươngpháp phát hiện nhanh và chính xác nồng độ protein. Dựa vào 2 thông số thựcnghiệm là hoạt tính enzyme và nồng độ protein, ta có thể xác định hoạt tínhriêng của enzyme tức là tỉ lệ hoạt tính enzyme với hàm lượng protein cótrong mẫu thử nghiệm. Hoạt tính riêng càng cao thì quá trình tinh sạch cànghiệu quả hay nói cách khác, mục tiêu của việc tinh sạch là làm tăng tối đahoạt tính riêng.III. Ly trích protein từ tế bàoKhi đã tìm ra thử nghiệm phù hợp và chọn được nguồn protein, chúng ta cầnphân đoạn dịch tế bào thành nhiều phần và xác định xem phần nào chứanhiều protein mục tiêu. Quá trình tìm phân đoạn mục tiêu được phát triểnbằng sự mày mò qua từng thí nghiệm. Bước đầu tiên là phá vỡ màng tế bào,tạo thành hỗn hợp đồng chất. Sau đó phân đoạn hỗn hợp bằng ly tâm, dịchnổi chứa phân tử có trọng lượng thấp, những phân tử có trọng lượng cao hơnlắng xuống đáy ống ly tâm. Dịch nổi lại được ly tâm lần nữa với lực mạnhhơn để tạo cặn và dịch nổi mới. Tiến trình này, được gọi là ly tâm phân đoạn,sẽ tạo được nhiều phân đoạn khác nhau với tỉ trọng giảm dần, mỗi phân đoạnnày chứa hàng trăm phân tử protein khác nhau, sẽ được tinh sạch sau khi đãqua thử nghiệm hoạt tính. Thông thường, một phân đoạn có hoạt tính cao sẽlà nguồn vật liệu cho các kỹ thuật tinh sạch hiệu quả.IV. Thu nhận protein mục tiêu dựa trên độ hoà tan, kích thước, điệntích, và liên kết ái lựcHàng ngàn protein đã được tinh sạch ở dạng có hoạt tính dựa trên những đặctính căn bản như độ hòa tan, kích thước, điện tích và liên kết ái lực. Thôngthường, một hỗn hợp protein sẽ trải qua nhiều giai đoạn phân tách, mỗi giaiđoạn dựa trên một đặc tính nhất định, để cuối cùng là một protein tinh sạch.Ở mỗi bước phân tách, thử nghiệm xác định hoạt tính và xác định nồng độprotein đều được thực hiện. Lượng đáng kể protein tinh sạch, khoảng vàimiligram, có thể giúp ta biết được cấu trúc không gian ba chiều và cơ chếphản ứng của nó. Vì vậy, sản lượng toàn phần là một điểm quan trọng củaquá trình tinh sạch. Các kỹ thuật tinh sạch thường dùng: tủa bằng muối, màngbán dẫn, sắc ký.IV.1. Tủa bằng muốiỞ nồng độ muối cao, phần lớn protein sẽ giảm tính hòa tan, hiện tượng nàygọi là tủa bằng muối (salting out). Mỗi loại protein sẽ kết tủa ở một nồng độmuối nhất định. Vì vậy, hiện tượng tủa bởi muối có thể được dùng để phânđoạn protein. Ví dụ như fibrinogen tủa ở nồng độ muối ammonium sulfate0.8 M trong khi phải đến nồng độ 2.4 M, albumin mới kết tủa. Hiện tượngnày được sử dụng để tăng nồng độ của một dung dịch protein loãng chứa cácphân đoạn có hoạt tính của các bước tinh sạch trước. Nếu cần thiết, lượngmuối có thể được loại bỏ bằng ...