Tinh sạch protein ( xác định kl và siêu ly tam protein)

Xác định khối lượng của protein Phép ghi phổ khối lượng là một kỹ thuật dùng để phân tích trong hóa học hữu cơ trong nhiều năm. Tuy nhiên, cho đến gần đây, khả năng bay hơi quá thấp của protein đã làm mất tác dụng của phép ghi phổ khối lượng trong việc nghiên cứu các phân tử này.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Tinh sạch protein ( xác định kl và siêu ly tam protein) Tinh sạch protein( xác định kl và siêu ly tam protein)VI. Xác định khối lượng củaproteinPhép ghi phổ khối lượng là một kỹthuật dùng để phân tích trong hóa họchữu cơ trong nhiều năm. Tuy nhiên,cho đến gần đây, khả năng bay hơiquá thấp của protein đã làm mất tácdụng của phép ghi phổ khối lượngtrong việc nghiên cứu các phân tửnày. Khó khăn này đã được khắc phụckhi có những kỹ thuật chuyển proteinvà những đại phân tử khác thành dạngkhí được đưa vào ứng dụng là matrix-assisted laser desorption-ionization(MALDI) và electrosprayspectrometry. Ở đây tập trung vào kỹthuật MALDI. Trong kỹ thuật này,những ion protein được phóng ra vàsau đó được tăng tốc qua một điệntrường. Những ion này sẽ di chuyểnqua một đường ống dài được hút chânkhông (flight tube), ion nhỏ nhất sẽ dichuyển nhanh nhất và đến đầu đọctrước nhất. Vì vậy, dựa vào thời gianbay (time of flight - TOF) trong điệntrường ta có thể biết khối lượng củaprotein (hay chính xác hơn là tỉ lệgiữa khối lượng với điện tích). Vớimột lượng nhỏ phân tử sinh học, dùnhỏ đến khoảng vài picomole đến vàifemtomole, vẫn có thể phân tích đượcvới cách này. Một máy phổ ghi khốilượng dạng MALDI-TOF dược dùngphân tích hỗn hợp insulin và β-lactoglobulin. kết quả khối lượng của2 protein này lần lượt là 5733.9 và18,364, so với kết quả tính toán la5733.5 và 18,388. Thí nghiệm nàycho thấy MALDI-TOF thật sự là mộtkỹ thuật chính xác để xác định khốilượng protein. Kỹ thuật này còn đượcứng dụng trong việc xác định dựa vàokhối lượng của peptide (peptide massfingerprinting). kỹ thuật này đã mởrộng khả năng ứng dụng của điện dihai chiều. Mẫu cần nghiên cứu đượcchiết và phân ra một cách riêng biệtbằng các phương pháp hóa học hayenzyme học. Khối lượng của các phânđoạn protein được xác định bằngphương pháp khối phổ. Cuối cùng,khối lượng của peptide được so vớinhững số liệu đã có được tính trênmáy vi tính. Kỹ thuật này cho kết quảkhá tốt. Ví dụ, trong số 150 proteincủa nấm men được phân tách bằngđiện di 2 chiều, kỹ thuật này đã giúpxác định được 80% protein.VII. Siêu ly tâmSiêu ly tâm không chỉ là một phươngpháp có thể phân tách một hỗn hợpthô các thành phần của tế bào mà cònrất hiệu quả trong việc phân tách vàphân tích những phân tử sinh học. Vớiphương pháp này, chúng ta không chỉxác định được khối lượng và tỉ trọngmà còn biết được cả hình dạng củamột phân tử cũng như phân tíchnhững tương tác giữa các phân tử. Đểcó được những điểm này, chúng tacần một diễn tả một cách toán học làmột phân tử bị tác động bởi lực ly tâmnhư thế nào. Dưới tác động của lực lytâm, một phân tử sẽ di chuyển quamột môi trường lỏng. Để biết đượctốc độ di chuyển của phân tử ta cầnphải tính hệ số lắng (s) theo côngthứcvới m là khối lượng phân tử, v là thểtích từng phần (nghịch đảo của tỉtrọng phân tử), p là tỉ trọng của môitrường và f là hằng số lắng thườngđược biểu hiện là đơn vị Svedberg (S)bằng 10-3 s. Giá trị S càng nhỏ, phântử di chuyển càng chậm.Vận tốc lắng của một phân tử phụthuộc vào khối lượng của nó. Mộtphân tử có cùng hình dạng cũng như tỉtrọng với các phân tử khác nhưngnặng hơn sẽ lắng nhanh hơnHình dạng cũng ảnh hưởng đến vậntốc lắng vì nó tác động đến độ nhớt.Hệ số ma sát của một phân tử cuộn lạithì nhỏ hơn những phân tử cồng kềnhdù chúng có cùng khối lượng. Vì vậy,một phần tử dạng thẳng lắng chậmhơn những phân tử hình cầu dù chúngcó cùng khối lượng.Một phân tử đặc di chuyển mau hơnmột phân tử ít đặc hơn bởi vì nghịchđảo của lực đẩy đối với phân tử đặcnhỏ hơn.Vận tốc lắng còn phụ thuộc vào tỉtrọng của dung dịch (p). các phân tửlằng khi p < 1, nổi khi p > 1 và khôngdi chuyển khi p = 1.Một kỹ thuật tách protein dựa vào hệsố lắng khác nhau của các protein làkỹ thuật ly tâm phân đoạn. đầu tiên làtạo khuynh độ tỉ trọng trong một ốngly tâm bằng cách trộn 2 dung dịch cótỉ trọng khác nhau, một có tỉ trọngcao, một có tỉ trọng thấp. Ví dụ, hỗnhợp sucrose 20% và sucrose 5% cókhuynh độ tỉ trọng từ 5% ở phía trênđến 20% ở đáy tube. một lượng nhỏdung dịch hổn hợp protein được nạpvào phía trên của khuynh độ về tỉtrọng. khi máy quay, protein sẽ dichuyển theo khuynh độ và tách ra dựatrên hệ số lắng của chúng. thời gianvà tốc độ ly tâm có được qua thựcnghiệm. Ta tạo một lỗ ở đáy ống lytâm để thu nhận các phân đoạn củaprotein.Khối lượng protein được xác địnhtrực tiếp bằng trạng thái lắng cân bằngcó nghĩa là mẫu được ly tâm ở vận tốcthấp đủ để sự lắng cân bằng với sựkhuếch tán. kỹ thuật này xác địnhkhối lượng protein rất chính xác và cóthể sử dụng cho protein không quabiến tính vì vậy cấu trúc bậc bốn củaprotein vẫn được bảo tồn. Đây là điểmlợi thế của phương pháp này so vớiSDS-PAGE, chỉ định được khối lượngcủa protein khi đã bị biến tính. Vớihai phương pháp này, SDS-PAGE chota biết khối lượng từng đơn phân, siêuly tâm phân đoạn cho ta biết khốilượng của dạng đa ...