Tuyển chọn một số chủng nấm mốc sinh tổng hợp chitinase phân lập từ đất

Enzyme chitinase có rất nhiều ứng dụng trong nông nghiệp, công nghiệp và y học. Bài viết này nghiên cứu về chiết tách enzyme chitinase từ các nguồn động vật, thực vật, đặc biệt là vi sinh vật với các đặc tính ưu việt như hoạt tính cao, ổn định với nhiệt độ và pH.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Tuyển chọn một số chủng nấm mốc sinh tổng hợp chitinase phân lập từ đấtTẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, TRƯỜNG ðH KHOA HỌC HUẾTẬP 1, SỐ 1 (2014)TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG NẤM MỐC SINH TỔNG HỢP CHITINASEPHÂN LẬP TỪ ðẤTPhạm Thị Ngọc Lan*, Võ Thị Thanh NhànKhoa Sinh học, Trường ðại học Khoa học Huế*E-mail: ngoclanz@yahoo.comTÓM TẮTEnzyme chitinase có rất nhiều ứng dụng trong nông nghiệp, công nghiệp và y học. Hiệnnay, người ta ñã nghiên cứu chiết tách enzyme chitinase từ các nguồn ñộng vật, thựcvật, ñặc biệt là vi sinh vật với các ñặc tính ưu việt như hoạt tính cao, ổn ñịnh với nhiệtñộ và pH.Trong số 120 chủng nấm mốc phân lập từ môi trường ñất ở 15 ñịa ñiểm khác nhauthuộc các huyện Phú Vang, Hương Trà và thành phố Huế, chúng tôi ñã tiến hành tuyểnchọn ñược hai chủng có khả năng sinh tổng hợp chitinase mạnh nhất là M15 và M71.Tiến hành ñịnh danh bằng giải trình tự gen 28S rRNA cho kết quả, chủng M15 làAspergillus fumigatus và chủng M71 là Aspergillus oryzae.Từ khóa: chitinase, nấm mốc, tuyển chọn1. MỞ ðẦUEnzyme chitinase có rất nhiều ứng dụng trong nông nghiệp, công nghiệp và yhọc. Khả năng khử chitin làm cho chitinase có giá trị trong phòng trừ dịch bệnh, giảm ônhiễm môi trường. Chitinase ñược khai thác sử dụng như là tác nhân phòng trừ sinhhọc. Chúng cũng có vai trò quan trọng trong sự hình thành thể nguyên sinh nấm, phòngtrừ muỗi, sản xuất các chitooligosaccharide hoạt hóa. Những thí nghiệm thử hoạt tínhkháng nấm bằng cách sử dụng Trichoderma harzianum phân hủy thành tế bào của nấmgây bệnh Colletotrichum gloeosporioides ñã ñược áp dụng trên thực nghiệm [1].Hiện nay, người ta ñã nghiên cứu chiết tách enzyme chitinase phân giải chitin từcác nguồn khác nhau: ñộng vật, thực vật, ñặc biệt là vi sinh vật với các ñặc tính ưu việtnhư hoạt tính cao, ổn ñịnh với nhiệt ñộ và pH.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU- Phương pháp phân lập và ñếm số lượng tế bào [2]Sử dụng phương pháp Koch ñể phân lập nấm mốc có khả năng phân giải chitintrên môi trường Czapek thạch ñĩa nhưng nguồn saccharose ñược thay bằng chitin.Xác ñịnh số lượng tế bào nấm mốc trong mẫu ñất bằng phương pháp ñếm giántiếp thông qua số lượng khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch ñĩa.40TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, TRƯỜNG ðH KHOA HỌC HUẾTẬP 1, SỐ 1 (2014)- Xác ñịnh khả năng phân giải chitin của các chủng nấm mốc [3]Phương pháp xác ñịnh sơ bộ hoạt lực phân giải chitinNguyên tắc: Trong môi trường chứa cơ chất thích hợp, vi sinh vật sẽ tiết raenzyme ngoại bào ñể phân hủy cơ chất làm cho ñộ ñục của môi trường trở nên tronghơn. ðộ lớn của môi trường trong suốt phản ánh hoạt lực của enzyme.Phương pháp tiến hành: Từ ống giống thuần khiết, cấy vạch từng chủng nấmmốc ñã thuần khiết lên các ñĩa Petri chứa môi trường Czapek cơ sở nhưng thay nguồncarbon bằng chitin, nuôi ở thời gian và nhiệt ñộ thích hợp. Sau khi nấm mốc mọc tiếnhành nhuộm bằng thuốc thử Lugol và ño kích thước vạch phân giải (ñường kính khuẩnlạc).Xác ñịnh hoạt tính enzyme bằng phương pháp khuếch tán trên thạchNguyên tắc: Khi chitinase có mặt trong môi trường chứa chitin nó sẽ phân giảichitin thành N-acetyl glucosamine và các cấu trúc mạch ngắn hơn không bắt màu vớithuốc thử Lugol. ðộ lớn của phần môi trường trong suốt (vòng phân giải) phản ánh hoạttính chitinase của chủng nghiên cứu. ðo ñường kính vòng phân giải ñể xác ñịnh hoạttính chitinase.Phương pháp tiến hành: Nuôi cấy nấm mốc trong môi trường Czapek dịch thểvới ñiều kiện thích hợp, thu dịch lọc ñể xác ñịnh hoạt tính chitinase.- Phương pháp phân loại chủng nấm mốcQuan sát hình thái: Quan sát ñại thể trên môi trường thạch ñĩa. Sử dụngphương pháp nuôi cấy nấm mốc trên phiến kính ñể quan sát cơ quan sinh sản.Giải trình tự geneNguyên tắc: Giải trình tự gene 28S rRNA và tra cứu trên Blast search ñể xácñịnh loài nấm mốc.Phương pháp tiến hành: Tách chiết DNA tổng số của nấm mốc theo protocol củaSambrook và Russell (2001) và nhân ñoạn gene mã hóa 28S rRNA bằng kỹ thuật PCR.Xác ñịnh trình tự ñoạn gene mã hóa 28S rRNA theo phương pháp của Sanger, sử dụngmáy ñọc trình tự tự ñộng ABI PRISM 3100 Avant Data Collection v1.0 và SequenceAnalysis [4]. Trình tự của ñoạn gene mã hóa 28S rRNA của mẫu ñược so sánh với cácñoạn gene mã hóa 28S rRNA ñã ñược công bố trên Blast Search. Sử dụng phần mềmClustal X, Bioedit ñể phân loại chủng nấm mốc [5].- Xử lý số liệu- Thí nghiệm ñược lặp lại 3 lần- Số liệu ñược tính giá trị trung bình và phân tích ANOVA (Duncans’testp20TẬP 1, SỐ 1 (2014)200616,675,00Từ 15 mẫu ñất và bùn, chúng tôi ñã thuần khiết ñược 120 chủng nấm mốc cókhả năng phân giải chitin. Qua ñánh giá sơ bộ khả năng phân giải chitin trên môi trườngthạch ñĩa cho thấy, các chủng nấm mốc có khả năng phân giải yếu và trung bình chiếmtỷ lệ rất cao (41,66% và 36,67%) trong khi các chủng nấm mốc phân giải chitin mạnhvà rất mạnh chỉ chiếm tỷ lệ 16,67% và 5,00%.Theo nghiên cứu của Nguyễn Thị Hà (2012) về nấm mốc phân giải chitin từrừng ngập mặn Cần Giờ (thành ...