Ứng dụng kỹ thuật realtime - PCR trong chẩn đoán virus túi (sacbrood virus) nhiễm trên đàn ong mật nuôi tại Hà Nội

Mục tiêu của nghiên cứu này nhằm đánh giá độ nhạy của kỹ thuật Realtime-PCR so với kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcription PCR) và khả năng phát hiện virus ở nồng độ thấp.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Ứng dụng kỹ thuật realtime - PCR trong chẩn đoán virus túi (sacbrood virus) nhiễm trên đàn ong mật nuôi tại Hà NộiHỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC VỀ SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LẦN THỨ 5ỨNG DỤNG KỸ THUẬT REALTIME-PCRTRONG CHẨN ĐOÁN VIRUS TÚI (SACBROOD VIRUS)NHIỄM TRÊN ĐÀN ONG MẬT NUÔI TẠI HÀ NỘIPHẠM HỒNG THÁI, TRỊNH THỊ THU THỦY, NGUYỄN THỊ LAN,NGUYỄN VĂN CƯƠNG, NGUYỄN VĂN GIANG,HÀ VIẾT CƯỜNG, Đ NG HƯƠNG LANTrường i hng nghiiViệt Nam nằm trong vùng có khí hậu nhiệt đới gió mùa nên có nguồn hoa và nguồn mậtphong phú phù hợp cho sự phát triển nghề nuôi ong mật. Do đó, nghề nuôi ong lấy mật từ lâu đãvà đang đóng một vai trò quan trọng trong đời sống con người bởi vì: Nó mang lại lợi nhuậnkinh tế to lớn cho người nuôi ong, có giá trị chữa bệnh, giải trí và giữ cân bằng sinh thái (PhùngHữu Chính, 2012; Crane, 1991).Cũng như các động vật khác ong mật dễ bị tấn công bởi một số vi sinh vật. Trong đó,nguy hiểm hơn cả là bệnh do virus, vì bệnh do virus không thể điều trị bằng thuốc kháng sinhđược. Trong số hơn 18 loại virus gây hại cho ong mật (Bakonyi et al., 2002; Aubert et al.,2007; Nielsen et al., 2008, Thai et al., 2011) thì Sacbrood virus gây chết ấu trùng, là mộttrong những bệnh virus nghiêm trọng nhất (Ball, 1999; Liu et al., 2010; Neumann and Careck,2010). Bệnh làm chết ấu trùng chủ yếu ở giai đoạn sau vít nắp và tiền nhộng. Khả năng lâynhiễm của virus này là rất lớn, chỉ cần một ấu trùng bệnh có thể lây nhiễm cho 3000 đàn ongkhỏe (Bailey and Ball, 1991). Việc phát hiện sớm virus này là vô cùng quan trọng để đưa raphương pháp phòng trị kịp thời và ngăn ngừa được tồn dư kháng sinh trong mật ong (Mascheret al., 1996). Trong số các phương pháp chẩn đoán hiện đại thì kỹ thuật Realtime-PCR (haycòn gọi là quantitative PCR/qPCR) được cho là nhanh và chính xác hơn cả (Fleige andMichael, 2006; Siede et al., 2008). Mục tiêu của nghiên cứu này nhằm đánh giá độ nhạy củakỹ thuật Realtime-PCR so với kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcription PCR) và khả năngphát hiện virus ở nồng độ thấp.I. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨUi ư ng: Mẫu ấu trùng ong được thu thập ở Gia Lâm và bảo quản trong cồn (ethanol 900)ở điều kiện phòng thí nghiệm cho đến khi tách chiết RNA.Phư ng hh hi R A ổng : RNA tổng số được tách chiết từ 18 mẫu ấu trùng ongbằng TRIzol-LS (Invitrogen). Trước khi tiến hành thực hiện phản ứng PCR, sản phẩm tách chiếtđược kiểm tra hàm lượng và độ tinh sạch bằng máy NanoDrop.Ci ử ng: Trong cả hai kỹ thuật RT-PCR và Realtime-PCR đều sử dụng cặp mồiSB1f-SB2r (Grabensteiner et al., 2001), mỗi mồi bao gồm 20 nucleotid sau đây: SB1f (ACCAAC CGA TTC CTC AGT AG), SB2r (CCT TGG AAC TCT GCT GTG TA)Quy trình RT-PCR: One step RT-PCR, với thành phần phản ứng và chu trình nhiệt như sau:1581HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC VỀ SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LẦN THỨ 5Thành phần phản ứng (20µl)Chu trình nhiệtH2O7,5µlNhiệt độ (ºC)Thời gianChu kỳDream Taq Master Mix 2X10,0µl4230 phút1xMồi SB 1 f0,5µl955 phút1xMồi SB 2 r0,5µl9445 giâyReverse aid0,5µl5430 giâyRNA1,0µl721 phút35xi n i n hẩ RT-PCR: Sau khi chạy xong phản ứng RT-PCR, sản phẩm khuếch đạiđược điện di trên gel agarose (1%) ở hiệu điện thế 100V trong thời gian 20 phút. Bản gel sau khiđiên di được đọc kết quả trên hệ thống UV geldoc-Biorad.Quy trình Realtime-PCR với thành phần phản ứng và chu trình nhiệt như sau:Thành phần phản ứng (20µl)Chu trình nhiệtH2O8,2µlNhiệt độ (ºC)Thời gianChu kỳQuantiFast SYBR Green RT-PCR10,0µl5010 phút1xMồi SB 1 f0,3µl955 phút1xMồi SB 2 r0,3µl9510 giâyQuantiFast RT Mix0,2µl5430 giâyRNA1,0µl721 phút950 giây40x1xXnh n ngvirh h hi n rênb nh: Pha loãng các mẫu RNA từ 10-1-7đến 10 và thực hiện phản ứng Realtime - PCR (theo quy trình như như mô tả ở trên).II. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬNTất cả các mẫu RNA tách chiết được đều có hàm lượng và độ tinh sạch cần thiết cho phảnứng PCR. Kết quả phân tích dược trình bày ở bảng 1 và hình 1 cho thấy: Trong khi kỹ thuậtRT-PCR chỉ phát hiện được 6/18 mẫu dương tính (33,33%) thì với kỹ thuật Realtime-PCR đãphát hiện hầu hết các mẫu mẫu dương tính, 17/18 (94,44%). Rõ ràng kỹ thuật Realtime-PCRcó độ nhạy cao hơn nhiều so với kỹ thuật RT-PCR.ng 1Kết quả kiểm tra của 2 kỹ thuật PCRTTSố hiệu mẫuPCRRT-PCRTTSố hiệu mẫuPCRRT-PCR1M18++10M33-+2M19--11M34-+3M20++12M49++4M26-+13M50-+5M27++14M51-+6M28++15M52-+7M29++16M53-+8M30-+17M54-+9M32-+18M55-+1582HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC VỀ SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LẦN THỨ 5Hình 1. Tỷ l chẩnna hai hư ng hRT-PCR và Realtime-PCRHình 2 cho thấy nồng độ RNA của virus trong các mẫu cho đường cong khuếch đại khácnhau. Những đường xuất hiện sớm là các mẫu có nồng độ virus cao hơn và ngược lại l ...