Ứng dụng kỹ thuật RT-PCR để xác định giới hạn vi sinh vật trong dược phẩm

Nghiên cứu được tiến hành với mục tiêu nhằm xây dựng phương pháp RT-PCR để xác định nhanh giới hạn vi sinh vật trong các mẫu dượcphẩm. Mời các bạn cùng tham khảo bài viết để nắm rõ nội dung chi tiết.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Ứng dụng kỹ thuật RT-PCR để xác định giới hạn vi sinh vật trong dược phẩmNghiên cứu Y họcY Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RT-PCR ĐỂ XÁC ĐỊNH GIỚI HẠN VI SINH VẬTTRONG DƯỢC PHẨMTrương Ngọc Lan**, Nguyễn Thanh Thuận*, Vũ Thanh Thảo*, Nguyễn Văn Thanh*, Trần Cát Đông*TÓM TẮTMở đầu: Dược phẩm cần phải đạt các tiêu chuẩn an toàn cao để không gây nguy hiểm cho người bệnh. Mộttrong các yếu tố nguy cơ là sự nhiễm các vi sinh vật. Thời gian xác định giới hạn vi sinh vật theo phương pháptruyền thống là từ 5 đến 7 ngày. Kỹ thuật RT-PCR cho phép xác định nhanh giới hạn nhiễm khuẩn trong dượcphẩm.Mục tiêu: Xây dựng phương pháp RT-PCR để xác định nhanh giới hạn vi sinh vật trong các mẫu dượcphẩm.Phương pháp: Dựa trên phương pháp PCR, tiến hành khảo sát các điều kiện tối ưu, độ đặc hiệu và độ nhạycủa các cặp cặp mồi chung và mồi đặc hiệu, khảo sát thời gian tăng sinh thích hợp để phát hiện từng loại vi sinhvật. Sau đó kiểm tra các thông số tối ưu bằng phản ứng RT-PCR.Kết quả: Xác định được nhiệt độ gắn mồi, nồng độ Mg2+ cho các cặp mồi. Các cặp mồi đều đạt độ đặc hiệu đểphát hiện vi khuẩn, vi nấm và vi sinh vật chỉ thị và có giới hạn phát hiện tốt. Phương pháp RT-PCR rút ngắnthời gian của kiểm tra giới hạn nhiễm vi sinh vật khoảng 5 lần so với phương pháp Dược điển.Kết luận: Phương pháp RT-PCR thích hợp để xác định nhanh giới hạn nhiễm khuẩn trong dược phẩm.Từ khóa: Kỹ thuật PCR, thử giới hạn vi sinh vật, kiểm nghiệm dược phẩm, phương pháp nhanh.ABSTRACTAPPLICATION OF RT-PCR TECHNIQUE FOR DETERMINATION OF MICROBIAL LIMIT TEST OFPHARMACEUTICALSTruong Ngoc Lan, Nguyen Thanh Thuan, Vu Thanh Thao, Nguyen Van Thanh, Tran Cat Dong* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 1 - 2011: 202 - 210Background: Microbial contamination in pharmaceutical products is one of the major causes of health risk toconsumers. Vietnamese Pharmacopoeia microbial limit test requires 5 - 7 days. RT-PCR detection ofmicroorganisms is a rapid, sensitive, and infallible method.Objectives: To develop a convenient, reproducible and rapid test for microbial limit of pharmaceuticalproducts.Methods: Base on PCR method, annealing temperature, Mg2+ concentration, sensitivity and specificity of theuniversal and specific primers, proliferating time for microorganisms were optimized. After that, the optimalconditions were applied to RT-PCR ( Reverse Transcriptase PCR) assay.Results: The annealing temperature, Mg2+ concentration of primer pairs were determined. All primers arespecific to detect bacteria, fungi and indicative microorganisms and have good detection limits. RT-PCR analysiscan be used for microbial limit determination 5 times faster than the standard method.Conclusions: RT-PCR is a suitable method for rapid and reliable detection of microbes pharmaceuticalsamples.Keywords: PCR, microbial limit test, pharmaceutical quality control, rapid method.*Khoa Dược, Đại học Y Dược TP.HCMTác giả liên lạc: PGS. TS Trần Cát Đông202** Trung tâm Y tế dự phòng tỉnh Bình DươngĐT: 08. 38295641 – 127Email: trancdong@gmail.comChuyên Đề Dược KhoaY Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011ĐẶT VẤN ĐỀDược phẩm là chế phẩm dùng để phòng vàNghiên cứu Y họcnay, kỹ thuật RT-PCR đã khá phổ biến ở nước tavà ngày càng được ứng dụng nhiều trong chẩnđiều trị bệnh, do đó cần phải đạt các tiêu chuẩnđoán, xét nghiệm.an toàn cao để không gây nguy hiểm cho ngườiVẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁPbệnh. Một trong các yếu tố nguy cơ là sự nhiễmCác chủng vi sinh vậtcác vi sinh vật, các vi sinh vật này có thể gâyCác chủng vi sinh vật sử dụng gồm cácbệnh trực tiếp hoặc gián tiếp làm hỏng dạng bàochủng chuẩn của ATCC và các chủng được phânchế, làm cho chế phẩm không chỉ mất đặc điểmlập và giữ tại Bộ môn Vi sinh - Ký sinh:cảm quan mà còn mất tác dụng điều trị. DượcEscherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureusđiển Việt Nam quy định các dạng thuốc dùngATCC 43300, Pseudomonas aeruginosa ATCCđường uống không chứa chất bảo quản phải đạt27853, Salmonella typhi, Streptococcus feacaliscác giới hạn về độ nhiễm khuẩn, việc xác địnhATCC 29213, Bacillus subtilis PY 79, Bacillusgiới hạn vi sinh vật được thực hiện theo phươngcereus, Shigella sp., Klebsiella sp., Candida albicanspháp tăng sinh, và nuôi cấy trên môi trườngATCC 10231, Aspergillus niger ATCC 16404 vàchọn lọc , tuy nhiên thời gian để có kết quả mộtMonascus purpureus.(1)mẫu kiểm nghiệm là từ 5 đến 7 ngày, nếu mẫukhông đạt chúng ta phải lặp lại một lần nữa,chưa kể đến phân lập vi khuẩn gây bệnh.Phương pháp này ngoài tốn kém thời gian, kếtquả còn phụ thuộc rất nhiều vào kỹ thuật viênkiểm nghiệm, thuốc sẽ lưu lại kho lâu hơn, gâytốn kém, tăng chi phí sản xuất, tăng giá thành.Trong khi hầu hết tuổi thọ các thuốc dùngđường uống ngắn (12 đến 24 tháng).Gần đây, các nước tiên tiến trên thế giới đãbắt đầu áp dụng các phương pháp xác địnhnh ...