ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR ĐỂ TÌM VI TRÙNG LAO (Polymerase Chain Reaction)

Mycobacterium tuberculosis không thuộc nhóm Gram + hay Gram – vì phương pháp nhuộm Gram không nhuộm được nó mặc dầu vi trùng này cũng có 1 màng bọc peptydoglycan. Ngoài màng này còn có 1 màng sáp làm cho các thuốc nhuộm Gram không thấm vào được. Phương pháp thường dùng để tìm M. tuberculosis là phết đàm bệnh nhân lên kiếng (slide smear) và nhuộm bằng Ziehl-Neelsen Stain (Acid-fast Staining Method). Thuốc nhuộm carbon-fuchsin được đổ lên smear có vi trùng rối nung sôi để chất màu có thể thấm vào vi trùng, sau đó rửa bằng...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR ĐỂ TÌM VI TRÙNG LAO (Polymerase Chain Reaction) ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR ĐỂ TÌM VI TRÙNG LAO (Polymerase Chain Reaction) Mycobacterium tuberculosis không thuộc nhóm Gram + hay Gram –vì phương pháp nhuộm Gram không nhuộm được nó mặc dầu vi trùng nàycũng có 1 màng bọc peptydoglycan. Ngoài màng này còn có 1 màng sáp làmcho các thuốc nhuộm Gram không thấm vào được. Phương pháp thườngdùng để tìm M. tuberculosis là phết đàm bệnh nhân lên kiếng (slide smear)và nhuộm bằng Ziehl-Neelsen Stain (Acid-fast Staining Method). Thuốcnhuộm carbon-fuchsin được đổ lên smear có vi trùng rối nung sôi để chấtmàu có thể thấm vào vi trùng, sau đó rửa bằng cồn acid (acid-alcohol). Vitrùng lao sẽ hiện ra với màu hồng rất dễ phân biệt với các vi trùng khác. Vi trùng M. tuberculosis rất khó nuôi và sinh trưởng rất chậm. Vì vậymuốn làm thử nghiệm để xem vi trùng nhạy cảm hay kháng thuốc thì cầnphải có một thời gian tối thiểu 3-4 tháng mới có kết quả. Dùng phương phápnuôi vi trùng bằng chất lỏng (liquid media) như BACTEC Systems (BectonDickinson, Sparks, MD,USA) thì cũng phải 3-4 tuần và cần nhiều dụng cụđặc biệt đắt giá. Hiện nay có rất nhiều nghiên cứu dùng PCR để định vi trùng lao(identify) và xét định xem vi trùng sẽ kháng loại thuốc nào. Phản ứng PCRsẽ cho kết quả nhanh chóng trong khoảng 3-4 tiếng đồng hồ. Bộ gen (genome) của Mycobacterium tuberculosis gồm 44,411,529base pairs với 4000 gen trong đó có gen IS6110 được rải rác nhiều nơi trongbộ gen. IS6110 có sequence rất cố định (very conservative). Phương phápPCR để tìm vi trùng Mycobacterium tuberculosis dựa trên amplification củagen IS6110 .DNA của Mycobacterium tuberculosis được trích tinh(purification) và dùng cho PCR với 2 dây mồi (primers). PCR sẽ amplifymột đoạn DNA (fragment) khoảng 120bp chuyên biệt cho gen IS6110. KhiPCR hoàn tất, chất thử nghiệm (sample) sẽ dùng để điện di trên Agarose gel(agarose gel electrophoresis) để xác định kết quả. Sự hiện diện của đoạnDNA chứng minh là có DNA của M. tuberculosis. Nếu không thì kết quả làâm (negative). Để tìm xem M. tuberculosis sẽ đề kháng loại thuốc nào thì chúng ta sẽdựa vào sequence của các gen ảnh hưởng cho loại thuốc đó để làm PCR. 1/ Đề kháng thuốc INH (isoniazid) Quan sát cho thấy là gen làm nhạy cảm thuốc loại INH là katG Codon315 (katG315). Nếu có sự biến dạng hay đột biến (mutation) ở base thứ 2của katG (AGC biến thành ACC hay ACA) thì vi trùng sẽ trở thành khángthuốc INH. Dùng DNA của M. tuberculosis và 2 giây mồi (primers) cósequence: 5’AGCTCGTATGGCACCGGAACC3’ (20mer primer) và5’AACGGGTCCGGGATGGTG3’ (18mer primer)(1) để làm phản ứng PCRsẽ cho ra 1 đoạn DNA dài 200bp. Khi cắt đoạn này với restriction enzymeHapII sẽ cho ra 1 đoạn DNA dài 153bp (chứng tỏ là vi trùng nhạy cảm vớiINH). Nếu vi trùng trở nên đề kháng thì mutation AGCà ACC sẽ làm chođoạn DNA có thệm 1 gốc hapII mới (new HapII restriction site), như vậyenzyme hapII sẽ cắt đoạn DNA thành 2 khúc nhỏ 132bp và 21bp. Khi điệngiải trện agarose gel ta sẽ thấy hiện ra 2 đoạn DNA. Như vậy là vi trùng đãkháng thuốc INH. 2/ Đề kháng thuốc rifampin: Gen cho nhạy cảm rifampin là rpoB. Khác với kháng INH, sự biếndạng (mutation) được thấy ở 3 nơi khác nhau trong gen rpoG (ở codon 516,526 và 531) khi có đề kháng thuốc Rifampin. Vì vậy trong phản ứng PCR tacần phải dùng ít nhất là 5 giây mồi (5 primers) mới xác định được các biếndạng của gen rpoG. Trở ngại khi dùng PCR Mặc dầu phản ứng PCR rất nhanh (3-4 giờ) nhưng phản ứng này cầndùng DNA tinh khiết trích từ vi trùng Mycobacterium tuberculosis. Muốn trích tinh chất DNA ta phải nuôi vi trùng M. tuberculosis chothật nhiều mới đủ số lượng để trích tinh, như vậy cũng phải cần 1 thời giankhá lâu trước khi thực hiện PCR. Sau khi làm phản ứng PCR phải dùng điện di trên Agarose để xem kếtquả (3-4 tiếng đồng hồ). Trước đây tôi đã có lần trình bày trên DDDK đề tài “Tạo DNA màkhông cần phải nuôi vi trùng”. Ở các phòng thí nghiệm, việc nuôi vi trùng như E. coli rất là thôngthường và dễ dàng. Chỉ cần cấy vi trùng trong 1 đêm là có thể có rất nhiềugram vi trùng để ly trích DNA. Trường hợp đặc biệt ở đây là khi gặp phải vitrùng khó nuôi (cần phải nuôi ở nhiệt độ thật cao, nhiệt độ thật thấp, khôngcần dưỡng khi anaerobic...) hoặc vi trùng sinh trưởng rất chậm như M.tuberculosis phải cần đến 3-4 tháng, hoặc khi ta chỉ có 1 số lượng DNA rất ít(như nước miếng, tóc, 1 giọt máu, 1 tinh trùng...) thì làm sao có thể có sốlượng DNA cần thiết để làm PCR. Một diếu tố (enzyme) mà tôi đã đưa ra công thức để trích tinh và cóhoạt tính rất mạnh được gọi là Phi29. Diếu tố này có khả năng amplify thậtnhiều DNA trong khoảng thời gian ngắn (3-4 giờ) và ở nhiệt độ 30o C (gọilà Rolling Circle Amplification). Với 1 đơn vị vi trùng (1 bacteria colony),Phi29 có thể amplify DNA của vi trùng lên đến vài ug DNA để có thể làmsequencing hoặc PCR. Nếu dùng 1 ug DNA thì trong khoảng 4 tiếng đồnghồ chúng ta có thể có đến 5 mg DNA tinh khiết để dùng cho các thử nghiệmmà khỏi phải mất thời giờ nuôi cấy vi trùng và ly trích DNA. Hiện nay qPCR (quick PCR) còn gọi là RT-PCR (Real Time PCR)được thông dụng hơn PCR vì RT-PCR dùng rất ít DNA mẫu (DNAtemplate) khoảng 1-10 pg cho phản ứng. Kết quả của phản ứng sẽ hiện lêntrên màn ảnh (monitor) của máy vi tính và những chi tiết dữ kiện (data) sẽđược giữ lại ở ổ cứng (hard drive) của máy. Như vậy khi dùng RT-PCRchúng ta sẽ có kết quả sau 3-4 giờ phản ứng mà khỏi phải dùng Agarose gel. Ts Lâm-Kim-Cương ...