Xác định ochratoxin trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS)

Các mẫu đầu tiên được trích xuất và sau đó được làm sạch bằng hộp mực SPE C18 cho Phân tích LC-MS/MS. Trong các điều kiện tối ưu hóa, giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) đối với ochratoxin lần lượt là 0,1 và 0,3 ng/mL. Sự phục hồi của ochratoxin từ ngũ cốc tăng vọt ở mức 2,5; 5 và 10 mg/kg dao động từ 70 đến 110%.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Xác định ochratoxin trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS)Tạp chí phân tích Hóa, Lý và Sinh học - Tập 20, Số 2/2015XÁC ĐỊNH OCHRATOXIN TRONG THỰC PHẨM BẰNG PHƢƠNG PHÁPSẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ (LC-MS/MS)Đến tòa soạn 25 – 1 – 2014Lê Thị Hồng HảoViện Ki m nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc giaSUMMARYDETERMINATION OF OCHRATOXINS IN FOOD BY HIGHPERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY – TANDEM MASSSPECTROMETRY (LC-MS/MS)Cereal are products essential in the our daily life However, cereals are prone tocontamination by ochratoxins, which is toxic, carcinogenic and thermostable. Asensitive, reliable method was proposed for the determination of ochratoxins in food byhigh-performance liquid chromatography- tandem mass spectrometry (LC-MS/MS).The samples were firstly extracted and then cleaned up with an SPE C18 cartridge forLC-MS/MS analysis. Under the optimized conditions, the limit of detection (LOD) andlimit of quantification (LOQ) for ochratoxins were 0,1 and 0,3 ng /mL, respectively.The recoveries of ochratoxins from cereal spiked at 2,5; 5 and 10 mg/kg ranged from70 to 110%. The developed method was applied to the detection of 15 samples peanut,corn and 5 samples wine and 2 samples were contaminated by ochratoxins with levelsbelow the newest legal limits.1. MỞ ĐẦUOchratoxins là một loại độc tố được sinhra bởi các chủng nấm mốc thuộc cácgiốngAspergilusochraceusvàPenicillium verrucusum. Theo tổ chứcnghiên cứu ung thư quốc tế (IRAC) thì116ochratoxins được xếp vào loại chất cókhả năng gây ung thư nhóm IIB. Độc tốnày đã được phát hiện trên nhiều nôngsản khác nhau bao gồm ngũ cốc và cácsản phẩm của chúng. Tại Việt nam, mứcdư lượng tối đa cho phép Ochratoxintrong ngũ cốc chưa qua chế biến là5µg/g, rượu vang là 2µg/g, ngũ cốc vàbột ngũ cốc là 3µg/g, thực phẩm dànhcho trẻ dưới 36 tháng tuổi là 0,52µg/g.Hiện chưa có quy định cụ thể nào vềmức MRL cho ochratoxin B kể cả trongnước và tiêu chuẩn Châu Âu (EN).Ochratoxin AOchratoxin BHình 1: Cấu trúc các OchratoxinsTrước đây, phương pháp thường đượcáp dụng là ELISA, dựa trên sự kết hợpđặc hiệu giữa kháng nguyên và khángthể. Kháng thể đặc hiệu với ochratoxinđược gắn lên bề mặt giếng nhựapolystryren. Tuy nhiên, phương phápnày lại dễ bị dương tính giả hoặc âmtính giả gây nhầm lẫn cho kết quả phântích. Gần đây, có khá nhiều phươngpháp được áp dụng xác định ochratoxinsnhư: sắc ký khí (Gas chromatographyGC), sắc ký lỏng hiệu năng cao (RFHPLC) dùng cột ái lực miễn dịch (IAC)nhưng mỗi phương pháp đều cá nhữngưu điểm và những hạn chế riêng.Hiện nay, phương pháp phân tích sắc kýlỏng khối phổ với những đặc điểm ưuviệt và độ chính xác cao đang được coilà phương pháp phân tích có giá trị pháplý để phát hiện và định lượng nồng độochratoxin ở lượng vết hay siêu vết1,2,3,4,5.2. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ2.1 Hóa chất: Tất cả các loại hóa chấtđều thuộc loại hóa chất tinh khiết phântích dùng cho sắc ký của hãng Merck(Đức ): Acetonitril, methanol, n-hexan,acid acetic…Các chất chuẩn được cung cấp bởi hãngSupelco.2.2 Trang thiết bị : Hệ thống sắc kýlỏng khối phổ khối phổ LC/MS/MS baogồm: HPLC 20 AXL của Shimadzu vàkhối phổ ABI 5500 QQQ của ApliedBiosystem. Cột sắc ký loại C18 (250mmx 4,6mm x 5µm) của Waters. Pha độnggồm amoniacetate 10mM và methanol,tốc độ pha động 1,0 ml/phút.3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN3.1 Tối ưu điều kiện máy LC/MS/MS3.1.1 Điều kiện khối phổĐiều kiện phân mảnh, điều kiện củanguồn và khí được tự động tối ưu trên hệthống MS thu được các ion con đặctrưng (bảng 1)Mảnh ion con m/z có cường độ lớn nhấtđược chọn dùng để định lượng, mảnhcon thứ 2 có cường độ thấp hơn dùng đểxác nhận chất phân tích117Bảng 1: Các thông số tối ưu cho ESI-MS/MSChấtIon mẹOchratoxin A402Ochratoxin B368Ion con358166,9324220DP (V)-100CE (V)-24-35-24-32CXP (V)-25-25-21-153.1.2 Điều kiện sắc ký:Ochratoxin A và B tách khỏi nhau khitrong bảng 2 .Các thu pic được cân đốiđược rửa giải theo chế độ gradient.các chất được tách ra khỏi nhau, pic thuChương trình gradient tối ưu được đưa rađược không bị tù, không bị chẻBảng 2: Chương trình gradient tối ưuThời gian (phút)0,01466,0110% CH3COONH49500959510mM% MeOH510010055Nồng độ amoni acetat ảnh hưởng đếnkhả năng tách và tín hiệu của cácochratoxin. Khảo sát nồng độamoniacetat trong pha động trongkhoảng 5mM – 0,1%.Khi nồng độ amoniacetate cao, số lượngion đi vào buồng ion của detector MStăng, gây cạnh tranh với các ion của chấtphân tích, làm giảm tín hiệu. Đồng thờinồng độ muối cao sẽ gây hại đến hiệulực và tuổi thọ của cột. Tại nồng độamoniacetate 10 mM các chất đều chotín hiệu cao nhất, hình dạng pic đẹp,không bị chẻ, doãng chân.3.2. Tối ưu h a điều kiện xử lý mẫuTiến hành khảo sát quá trình chiết cácochratoxin: Cân chính xác khoảng 5gmẫu ngô đã đồng nhất vào ống ly tâm 50ml. Thêm 100 µl chuẩn hỗn hợp 100ng/ml, thêm 30 ml CHCl3, lắc xoáy. Lấy ...