Xác định và đánh giá sự tăng sinh vi khuẩn B. subtilis HU58 qua đường tiêu hóa

Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm xác định và đánh giá khả năng tăng sinh bào tử B. subtilis HU58 qua đường tiêu hóa. Kết quả cho thấy trình tự các nucleotide của gen mã hóa ARNr 16s của vi khuẩn B. subtilis HU58 đồng nhất tới 99% với dữ liệu của Ngân hàng Gen.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Xác định và đánh giá sự tăng sinh vi khuẩn B. subtilis HU58 qua đường tiêu hóaTẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2014XÁC ĐỊNH VÀ ĐÁNH GIÁ SỰ TĂNG SINH VI KHUẨNB. SUBTILIS HU58 QUA ĐƢỜNG TIÊU HÓAHồ Anh Sơn*; Nguyễn Lĩnh Toàn*Nguyễn Thị Mai Phương**; Đào Chí Dũng***TÓM TẮTNghiên cứu nhằm xác định và đánh giá khả năng tăng sinh bào tử B. subtilis HU58 quađường tiêu hóa. Kết quả cho thấy trình tự các nucleotide của gen mã hóa ARNr 16s của vikhuẩn B. subtilis HU58 đ ng nhất t i 99 v i dữ liệu của Ngân hàng Gen. Số lượng bào tử B.subtilis HU58 tăng sinh cực đại ở thời điểm 7 giờ và giảm dần sau 7 ngày uống vi khuẩn.* Từ khóa: B. subtilis HU58; Synbiotic; Chuột nhắt.IDENTIFING AND EVALUATING THE PROLIFERATIVEABILITY OF B. SUBTILIS HU58 VIA DISGESTIVE SYSTEMSUMMARYThe research aimed to identify and evaluate the proliferative ability of B. subtilis HU58 viagastro-intestinal tract. The results showed that nucleotide sequence of the gene encoding forARNr 16s of B. subtilis HU58 was identical up to 99% with the genbank reference. B. subtilis HU58proliferated maximum at 7 hours and then decreased gradually after 7 days of oral administration.* Key words: B. subtilis HU58; Synbiotic; Mice.ĐẶT VẤN ĐỀTrên thế gi i, việc sử dụng thực phẩmchức năng có chứa vi khuẩn có lợi đangđược quan tâm do khả năng làm tăng đápứng miễn dịch; tăng khả năng thực bào;chống ung thư, chống ỉa chảy, dị ứng;ngăn chặn hội chứng loãng xương; giảmchất béo trong huyết thanh và đườngtrong máu. Sản phẩm này có tên synbioticthuéc ®Ò tµi “Nghiên cứu sản xuất chế phẩmsynbiotic từ vi khuẩn sinh bào tử và cámgạo” (Mã số: KC04.TN01/11-15) được tạora từ phối trộn giữa xylooligosaccharides(XOS) từ cám gạo v i bào tử của chủngvi sinh vật sinh bào tử B. subtilis HU58.Để có cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theovà đưa sản phẩm ra thị trường, cần xácđịnh chính xác sự có mặt của bào từ vàkhả năng sinh bào tử sau khi động vậtthực nghiệm uống chủng vi sinh vật này.* Học viện Quân y** Viện Công nghệ Sinh học*** Viện Y học Cổ truyền Quân độiNgười phản hồi (Corresponding): Hå Anh S¬n (hoanhson@yahoo.com)Ngày nhận bài: 12/01/2014; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 09/03/2014Ngày bài báo được đăng: 20/03/201437TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2014ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁPNGHIÊN CỨU1. Đối tượng nghiên cứu.Chuột nhắt trắng do Ban Động vật,Học viện Quân y cung cấp, không phânbiệt giống, khoẻ mạnh, đạt tiêu chuẩn thínghiệm, cân nặng 20,0  2,0 g. Nuôi chuộttrong điều kiện nhiệt độ 24 ± 20C, ánhsáng tự nhiên, nư c và thức ăn được nấuchín, bảo đảm theo nhu cầu. Quá trình nuôibắt đầu trư c khi tiến hành thí nghiệm ítnhất 3 ngày.2. Phương pháp nghiên cứu.Tổng số g m 4 chuột, nuôi riêng từngcon. Cho mỗi chuột uống một liều duynhất, hòa tan 1 x 1010 CFU vi khuẩn trongnư c cất. Lấy phân vào các thời điểmkhác nhau (tối đa sau 7 ngày). Trư c khithu thập phân, đáy hộp thu thập được trảigiấy trắng đã sấy vô khuẩn. Đưa chuộtvào từng hộp riêng lẻ. Thu thập, đánh sốcác mẫu phân riêng biệt của từng chuột.* Xác định trình tự gen mã hóa ARNr16s của vi khuẩn B.subtilis HU58:- Tách ADN tổng số: tách ADN tổng sốtừ các mẫu vi khuẩn trong phân theophương mô tả của Sambrook và Rusell[9]. Xác định hàm lượng ADN bằng cáchđo độ hấp thụ ánh sáng ở bư c sóng 260nm (A260). Kiểm tra các mẫu ADN bằngđiện di trên gel agarose 1 , sau đó nhuộmbằng ethidium bromide, soi dư i đèn tửngoại và chụp ảnh.- Giải trình tự gen mã hoá ARNr 16S:để xác định một cách chính xác chủng B.subtilis HU58 có mặt trong phân chuột,sử dụng kỹ thuật giải trình tự gen đoạnmã hoá ARNr 16S. Cặp m i vạn năng(universal primers) 27F và 1527R [8] sửdụng cho xác định trình tự ARNr 16S củaB. subtilis HU58 có trình tự như sau:- 27f: 5-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3- 1527R: 5-AAAGGAGGTGATCCAGCC-3Phản ứng PCR có thành phần g m: 6 lhỗn hợp DTCS Master mix, 1 l khuôn,1 l m i (8UA hoặc 1492R), H2O vô trùngvừa đủ 20 l. Thực hiện phản ứng PCRtheo chu trình nhiệt: 96oC trong 1 phút đểkhởi động nóng, tiếp theo là 35 chu kỳg m 3 bư c: 96oC trong 30 giây để làmbiến tính ADN, 60oC trong 30 giây để gắnm i và 60oC trong 4 phút để kéo dàichuỗi. Mẫu sau đó được ủ tiếp ở 60oCtrong 7 phút và giữ ở 4oC cho đến khiphân tích.* Đếm quần thể vi khuẩn trong phân:Cân 0,1 g phân pha v i 0,9 ml đệmPBS, sau đó trộn (votex) kỹ để phân tanhoàn toàn và ủ trong tủ ấm ở 650 trong1 giờ. Đếm quần thể vi khuẩn ngay trongngày. Xác định mật độ vi khuẩn bằngphương pháp pha loãng và cấy trải trênđ a thạch chứa môi trường labo agar.Ủ các đ a thạch sau khi cấy ở 37oC trong48 giờ cho đến khi các khuẩn lạc hìnhthành hoàn toàn.KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU1. Nh n ng vi hu n B. subtilis HU58trong phân.Trong môi trường labo, các vi khuẩn B.subtilis HU58 có hình thái đặc trưng v iđặc điểm: khuẩn lạc khô, màu xám nhạt,có nếp nhăn, mép l i lõm.39TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2014HU58. Giếng 1: Thang chuẩn ADN 1kb.Giếng 2: ADN B. s ...