Xác định vị trí phân loại của họ limnocharitaceae bằng dữ liệu phân tử dựa trên dna tổng từ quy trình tách chiết nhanh

Nghiên cứu này giới thiệu một quy trình tách chiết DNA nhanh và hiệu quả từ phương pháp CTAB cải tiến, từ đó, áp dụng vào phản ứng PCR khuếch đại vùng trình tự matK của loài Limnocharis flava nhằm xác định vị trí phân loại của họ Limnocharitaceae. Kết quả cho thấy, trình tự của sản phẩm PCR được khuếch đại từ DNA tổng được tách chiết bằng phương pháp CTAB cải tiến cho kết quả có độ tin cậy cao.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Xác định vị trí phân loại của họ limnocharitaceae bằng dữ liệu phân tử dựa trên dna tổng từ quy trình tách chiết nhanh Chuyên san Phát triển Khoa học và Công nghệ số 4 (1), 2018 XÁC ĐỊNH VỊ TRÍ PHÂN LOẠI CỦA HỌ LIMNOCHARITACEAE BẰNG DỮ LIỆU PHÂN TỬ DỰA TRÊN DNA TỔNG TỪ QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT NHANH Huỳnh Nữ Băng Thùy, Nguyễn Anh Đức, Trình Trung Hiếu, Võ Tuấn Dũng, Văn Hồng Thiện* Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm – Trường Đại học Công nghiệp TP.HCM *Tác giả liên lạc: vanhongthien@iuh.edu.vn (Ngày nhận bài: 22/12/2017; Ngày duyệt đăng: 22/3/2018) TÓM TẮT Nghiên cứu này giới thiệu một quy trình tách chiết DNA nhanh và hiệu quả từ phương pháp CTAB cải tiến, từ đó, áp dụng vào phản ứng PCR khuếch đại vùng trình tự matK của loài Limnocharis flava nhằm xác định vị trí phân loại của họ Limnocharitaceae. Kết quả cho thấy, trình tự của sản phẩm PCR được khuếch đại từ DNA tổng được tách chiết bằng phương pháp CTAB cải tiến cho kết quả có độ tin cậy cao. Ngoài ra, phân tích phả hệ cũng cho thấy, các loài thuộc họ Limnocharitaceae đều xếp gọn bên trong các loài thuộc họ Alismataceae, từ đó đã khẳng định lại vị trí phân loại của họ Limnocharitaceae. Từ khóa: Tách chiết DNA, limnocharis flava, limnocharitaceae, alismataceae. TAXONOMIC IDENTITY OF LIMNOCHARITACEAE BASED ON MOLECULAR DATA FROM A RAPID DNA EXTRACTION PROTOCOL Huynh Nu Bang Thuy, Nguyen Anh Duc, Trinh Trung Hieu, Vo Tuan Dung, Van Hong Thien* Institute of Biotechnology and Food Technology – Industrial University of Ho Chi Minh City *Corresponding Author: vanhongthien@iuh.edu.vn ABSTRACT In this study, we used a rapid and effective DNA extraction protocol which are modified from CTAB method to amplify matK sequence of Limnocharis flava for determination of taxonomic position of Limnocharitaceae family. The data demonstrated that the matK sequence amplified by this protocol had high reliability. Furthermore, phylogenetic analysis revealed that species of Limnocharitaceae nested in Alismataceae family, and thus taxonomic position of Limnocharitaceae family was re-classified. Keywords: DNA extraction, limnocharis flava, limnocharitaceae, alismataceae. TỔNG QUAN Limnocharitaceae vào họ Alismataceae Limnocharitaceae là một họ thực vật với (www.theplantlist.org). Tuy nhiên, ở Việt số lượng loài khá ít (Phạm Hoàng Hộ, Nam, Phạm Hoàng Hộ (2000) cho rằng, 2000). Theo các bằng chứng về phôi, sinh Limnocharitaceae là một họ riêng biệt và hóa và cả phân tử đã cho thấy, họ chỉ gồm 2 loài là Limnocharis flava và Limnocharitaceae có mối quan hệ rất gần Tenagocharis latifolia. Do đó, đề tài với họ Alismataceae (Donald and nghiên cứu này sẽ cung cấp thêm dữ liệu Nicholas, 2013) và hiện nay, trên hệ thống phân tử (vùng trình tự matK của gen lục thông tin về thực vật của Vườn thực vật lạp) nhằm góp phần xác định vị trí phân Hoàng gia Anh (Kew) đã nhập họ loài của họ Limnocharitaceae (với đại diện 76 Chuyên san Phát triển Khoa học và Công nghệ số 4 (1), 2018 là loài L. flava). phút (3 phút đảo đều); (3) Bổ sung 800 µl Hiện nay, việc ứng dụng các chỉ thị phân chloroform : isoamyl alcohol (24 : 1), đảo tử trong nghiên cứu phân loại học ở thực đều; (4) Ly tâm 13000 vòng trong 10 phút vật trở nên rất phổ biến trên thế giới ở 4ºC, thu dịch nổi trên cùng sang 1 (Palmer et al., 2004) và Việt Nam (Văn eppendorf khác; (5) Thêm 800 µl Hồng Thiện, 2017). Để thành công trong isopropanol, đảo nhẹ, để ủ ở tủ -20ºC trong các phản ứng PCR thì một phần công việc 30 phút; (6) Ly tâm 13000 vòng trong 10 hết sức quan trọng là tách chiết DNA tổng phút ở 4ºC, loại bỏ dịch nổi và thu tủa; (7) số. Hiện tại, hầu hết các nghiên cứu có liên Thêm 800 µl ethanol 70%, ly tâm 13000 quan đến quá trình tách chiết DNA đều tập vòng trong 10 phút ở 4ºC thu tủa; (8) Để trung vào 2 phương pháp: (1) sử dụng các khô tủa 15-25 phút, thêm 50 µl dung dịch bộ kít chuyên dụng và (2) phương pháp TE và bảo quản ở -20ºC. CTAB. Phương pháp đầu tiên có ưu điểm Phương pháp PCR là cho kết quả nhanh, DNA khá tinh sạch, Vùng trình tự matK của gen lục lạp được tuy nhiên chi phí lại khá cao. Ngược lại, khuếch đại bằng cặp mồi theo Fazekas et phương pháp CTAB ít tốn kém hơn nhưng al. (2012). Phản ứng PCR được thực hiện quy trình thực hiện phức tạp và thường mất trên máy Mastercycler (hãng Eppendorf, thời gian. Do vậy, trong khuôn khổ bài báo Đức) với các thành phần như sau: 12,5 µl này, chúng tôi giới thiệu 1 quy trình tách Go Taq Green Master Mix (hãng Promega, chiết DNA nhanh từ phương pháp CTAB Mỹ), 1,25µl mỗi mồi xuôi và ngược (10 có cải tiến cũng như quy trình chuẩn dung µM), 9 µl nước khử ion và 1 µl DNA mẫu. cho phản ứng PCR từ phương pháp này. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR gồm: 5 Sản phẩm DNA tổng số sau khi được tách phút ở 95°C; 35 chu kỳ gồm: biến tính (1 chiết sẽ được đưa ngay vào thực hiện phản phút ở 94°C), bắt cặp (1 phút 30 giây ở ứng PCR mà không cần phải qua các bước 55oC) và kéo dài (1 phút 30 giây ở 72°C); định tính hay định lượng. kéo dài ở 72°C trong 10 phút. Sản phẩm PCR được tin sạch và giải trình NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG tự tại Công ty Nam Khoa, quận 7, PHÁP NGHIÊN CỨU TP.HCM. Nguyên vật liệu Phương pháp xây dựng cây phát sinh loài Mẫu Limnocharis flava được thu tại huyện Kết quả giải trình tự 2 chiều được kiểm tra Bến Lức, tỉnh Long An với 3 cá ...