Xây dựng qui trình real-time PCR kết hợp HRM phát hiện gen gây độc stx1, stx2, eae và ehxA của nhóm vi khuẩn E. Coli sinh độc tố shiga (STEC)

Bài viết trình bày việc xây dựng quy trình phát hiện các gen gây độc stx1, stx2, eae và ehxA của nhóm vi khuẩn STEC dựa trên kỹ thuật real-time PCR kết hợp phân tích HRM.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Xây dựng qui trình real-time PCR kết hợp HRM phát hiện gen gây độc stx1, stx2, eae và ehxA của nhóm vi khuẩn E. Coli sinh độc tố shiga (STEC)Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 5 * 2016 XÂY DỰNG QUI TRÌNH REAL-TIME PCR KẾT HỢP HRM PHÁT HIỆN GEN GÂY ĐỘC STX1, STX2, EAE VÀ EHXA CỦA NHÓM VI KHUẨN E. coli SINH ĐỘC TỐ SHIGA (STEC) Nguyễn Quốc Tuấn*, Ngô Kế Sương**, Nguyễn Đăng Quân***, Nguyễn Hoàng Chương****TÓM TẮT Đặt vấn đề: STEC (Shiga toxin producing Escherichia coli) là nhóm vi khuẩn gây ra các triệu chứng nhưviêm đại tràng xuất huyết (hemorrhagic colitis) và hội chứng urê huyết tan máu (hemolytic uremic syndrome), cóthể dẫn đến suy thận và tử vong. Khả năng gây bệnh của nhóm E. coli này do các gen gây độc stx1, stx2, eae,ehxA quyết định. Vì vậy, cần phải có một quy trình phân tử phát hiện các gen gây độc như trên ở nhóm vi khuẩnSTEC phục vụ cho việc xác định chính xác nguyên nhân của các vụ ngộ độc thực phẩm do E. coli sinh độc tốshiga (STEC) gây ra cũng như áp dụng cho các nghiên cứu về dịch tễ học loài vi khuẩn này. Mục tiêu: Xây dựng quy trình phát hiện các gen gây độc stx1, stx2, eae và ehxA của nhóm vi khuẩn STECdựa trên kỹ thuật real-time PCR kết hợp phân tích HRM. Phương pháp nghiên cứu: Cắt ngang bao gồm thiết kế các cặp primer phát hiện các gen gây độc bằng kỹthuật real-time PCR HRM; xây dựng và khảo sát độ đặc hiệu của phản ứng real-time PCR HRM; đánh giá quytrình mới xây dựng trên các chủng E. coli phân lập từ thực phẩm. Kết quả: xây dựng thành công quy trình real-time PCR kết hợp HRM phát hiện đặc hiệu bốn gen gây độcstx1, stx2, eae, ehxA ở các chủng vi khuẩn STEC. Trên 30 mẫu E. coli phân lập từ thực phẩm, quy trình đã pháthiện được 8 mẫu mang các gen gây độc. Kết luận: Quy trình real-time PCR kết hợp HRM có thể được ứng dụng hiệu quả trong nghiên cứu và kiểmsoát các vụ ngộ độc thực phẩm do STEC gây ra. Từ khóa: gen gây độc, STEC, real-time PCR, HRM.ABSTRACT APPLICATION OF REAL-TIME POLYMERASE CHAIN REACTION COUPLED WITH HIGH- RESOLUTION MELTING ANALYSIS FOR DETECTION OF STX1, STX2, EAE, EHXA GENES Nguyen Quoc Tuan, Ngo Ke Suong, Nguyen Dang Quan, Nguyen Hoang Chuong * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement of Vol. 20 - No 5 - 2016: 374 - 380 Backgrounds: Shiga toxin producing Escherichia coli (STEC) is a group of bacteria causing hemorrhagiccolitis and hemolytic uremic syndrome which may lead to kidney failure and mortality. The pathogenicity ofSTEC is conferred by virulent genes comprising stx1, stx2, eae and ehxA. Therefore, a detection protocol for thesevirulent genes would be essential for identifying the microbial that is one of the most serious causes of foodpoisoning. The protocol would also be useful for epidemiological studies of STEC. Objectives: The aim of this study was to set up a protocol based on the real-time polymerase chain reaction(PCR) high-resolution melting (HRM) technique for detection of four virulent genes of STEC comprising stx1,stx2, eae and ehxA. * Viện Y tế Công cộng TP. Hồ Chí Minh ** Viện Sinh học Nhiệt đới - Viện HLKH&CN Việt Nam *** Trung tâm CNSH Tp.HCM **** Trường Đại học KHTN – ĐHQG Tp.HCM Tác giả liên lạc: ThS. Nguyễn Quốc Tuấn ĐT: 0984444839 Email: nguyenquoctuan@iph.org.vn374 Chuyên Đề Y Tế Công CộngY Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 5 * 2016 Nghiên cứu Y học Methods: A laboratory study was performed to design primers for the real-time PCR, asses the specificity ofthe real-time PCR protocol and applying this protocol to detect the virulent genes in 30 E. coli strains isolatedfrom food. Results: A protocol was developed successfully for detection four virulent genes stx1, stx2, eae, ehxA inSTEC strains. There were 8 out of 30 E. coli strains carrying one of the virulent genes isolated from food. Conclusion: Real time PCR HRM protocol can be applied for detecting for STEC in food poisoningincidents. Keywords: virulent genes, STEC, real-time PCR, HRM.ĐẶT VẤN ĐỀ trình phát hiện các gen gây độc STEC dựa trên kỹ thuật real-time PCR kết hợp phân tích HRM STEC là nhóm vi khuẩn gây bệnh lây truyền (high resolution melting). Đây là kỹ thuật choqua thực phẩm và là mối quan tâm sức khỏe phép phát hiện các gen gây độc ngay khi phảncộng đồng quan trọng. Khả năng gây bệnh của ứng PCR đang diễn ra với giá trị Ct (chu kỳnhóm E. coli này do các gen gây độc quyết định, ngưỡng). Sau khi kết thúc phản ứng real-timetrong đó bao gồm stx1, stx2, eae, ehxA. ...