Xây dựng quy trình chiết xuất và phương pháp định lượng Stigmasterol trong cây ráy (Alocasia odora (Roxb.) C. Koch) bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

Hiện nay, xu hướng và yêu cầu tiêu chuẩn hóa chất lượng dược liệu theo WHO nói chung cũng như ở Việt Nam nói riêng là phải xây dựng được quy trình xác định hàm lượng hoạt chất hoặc chất đặc trưng chiếm tỷ lệ lớn trong dược liệu. Vì vậy trong bài báo này, các tác giả giới thiệu kết quả nghiên cứu phương pháp định lượng stigmasterol trong cây ráy bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Xây dựng quy trình chiết xuất và phương pháp định lượng Stigmasterol trong cây ráy (Alocasia odora (Roxb.) C. Koch) bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao TẠP CHÍ KHOA HỌC, Đại học Huế, Số 63, 2010 XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT VÀ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG STIGMASTEROL TRONG CÂY RÁY (Alocasia odora (Roxb.) C. Koch) BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Trần Hữu Dũng Trường Đại học Y Dược, Đại học Huế Đặng Thị Ngọc Hoa Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế TÓM TẮT Quy trình chiết xuất stigmasterol toàn phần từ bột dược liệu ráy (Alocasia odora (Roxb.) C. Koch) trên soxhlet trong 5 giờ trong dung môi chloroform được thực hiện và kiểm soát bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng khi triển khai trên hệ dung môi n-hexan/ethyl axetat (8:2), xác định vết bằng thuốc thử Liebermann-Burchard. Hàm lượng stigmasterol được xác định bởi phương pháp HPLC nhanh chóng và có độ nhạy cao, trên cột C8 với nhiệt độ cột 300C ± 1, hệ dung môi pha động là acetonitril/đệm phosphate (93:7) pH 4,8 với tốc độ dòng 1ml/phút, thể tích tiên 20µl, bước sóng phát hiện tại 195nm. Phương pháp HPLC cho tương thích cao với các thông số sắc ký có RSD < 2%. Khoảng tuyến tính của nồng độ stigmasterol được khảo sát từ 10–300ppm (r = 0,9995). Phương pháp được thẩm định cho độ chính xác và độ đúng thích hợp với tỷ lệ phục hồi của stigmasterol từ bột ráy đạt 95,2%, giới hạn định lượng là 10ppm. I. Đặt vấn đề Cây ráy (Alocasia odora (Roxb.) C. Koch) hay còn gọi là môn bạc hà, ráy bạc hà, bạc hà; đôi khi còn gọi là ráy dại, dã vu. Thân rễ ráy được dùng làm thuốc trong phạm vi kinh nghiệm nhân dân, chủ yếu chữa bệnh ngoài da như mề đay đơn ngứa, lỡ khó chữa, sần da chảy nước (nấu nước tắm rửa), xát vào nơi bị lá han gây ngứa tấy; nhiều nơi dùng với tác dụng giảm đau do vẹo cổ, đau xương khớp, điều trị gan nhiễm mỡ [1], [3]. Phytosterol là một trong những thành phần hóa học của cây ráy có hoạt tính sinh học và hàm lượng cao. Stigmasterol là một trong những thành phần chính của phytosterol, có tác dụng giảm lượng cholesterol trong máu, kháng viêm, dùng trong tổng hợp progesterone, và là tiền chất của vititam D3 [3], [4], [6]. Hiện nay, xu hướng và yêu cầu tiêu chuẩn hóa chất lượng dược liệu theo WHO nói chung cũng như ở Việt Nam nói riêng là phải xây dựng được quy trình xác định hàm lượng hoạt chất hoặc chất đặc trưng chiếm tỷ lệ lớn trong dược liệu [2], [7]. Vì vậy, 43 trong bài báo này, chúng tôi giới thiệu kết quả nghiên cứu phương pháp định lượng stigmasterol trong cây ráy bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). 2. Thực nghiệm nghiên cứu 2.1. Xử lý mẫu nghiên cứu Thân rễ ráy (Alocasia odora (Roxb.) thu hái vào tháng 12 năm 2009, gọt bỏ vỏ, rửa sạch bằng nước, thái từng lát mỏng 2-5mm, sấy âm can, đặt trong tủ sấy đến khô, nghiền mịn, thu được bột ráy, bảo quản trong bình nhựa kín. Chuẩn stigmasterol 95% của Sigma-aldrich (No: 027K5302), bản Silica gel F254 (Merck), máy HPLC SHIMADZU LC-20A series 2000-PAD detector, cột Sulpenco C8 và C18 (150 x 4,6mm, 5µm) và các dung môi hoá chất tinh khiết (PA và HPLC). 2.2. Khảo sát hệ dung môi triển khai sắc kí lớp mỏng định tính stigmasterol Dung dịch thử: bột ráy khuấy từ trong 2 giờ với CHCl3/MeOH = 2:1(v/v), lọc qua giấy lọc. Dịch chiết được thủy phân bằng HCl 1M/MeOH trong 45 phút ở 800C, sau đó trung hòa bằng KOH 20%/MeOH đến pH > 7, chiết trong ete dầu hoả và loại nước bằng Na2SO4 khan, cô dịch ete thu được cắn. Hòa tan cắn trong 1ml CHCl3 để chấm sắc ký. Dung dịch chuẩn: cân 11.4mg stigmasterol hòa tan trong 1ml CHCl3 Triển khai trên bản Silica gel F254 với các hệ dung môi khác nhau: n-hexan/ethyl acetate (9:1), n-hexan/ethyl acetate (8:2), n-hexan/ethyl acetate (7:3), CHCl3/MeOH (98:2) và CHCl3/CH3COCH3 (8:2) để chọn hệ pha động thích hợp nhất [2]. Phát hiện peak phytosterol bằng thuốc thử Liebermann-Burchard. 2.3.Xây dựng quy trình chiết stigmasterol toàn phần bằng phương pháp chiết Soxhlet Cân 5g bột ráy, ngâm lạnh 12 giờ với các hệ dung môi chiết CHCl3/MeOH (1:1), (2:1) và CHCl3 100%, chiết Soxhlet với cùng hệ dung môi ngâm lạnh trong 3 giờ, ở 650C để chọn hệ dung môi thích hợp nhất cho việc khảo sát thời gian chiết kiệt stigmasterol tại 3, 4 và 5h để chọn thời gian chiết tối ưu [6]. Hiệu quả chiết xuất được đánh giá bằng tín hiệu peak stigmasterol trên TLC với thuốc thử Liebermann-Burchard sau khi dịch chiết được thủy phân bằng HCl 1M/MeOH trong 45 phút ở 800C. 2.4. Xây dựng phương pháp định lượng stigmasterol trên HPLC Khảo sát các điều kiện cột sắc ký pha đảo (C8 và C18), các hệ dung môi triển khai acetonitril (ACN): đệm phosphate 0,025M với các tỷ lệ khác nhau (90:10, 93:7, 95:5), tại các pH đệm khác nhau (5,3; 5,8; 6,5; 4,8) và thay đổi tốc độ dòng khác nhau (1,0; 1,2; 1,5ml/phút) trên máy HPLC SHIMADZU LC-20A series 2000-PAD detector [6]. 44 Dung dịch thử: cắn thu được sau khi thuỷ phân được hòa tan trong 2ml MeOH. Dung dịch chuẩn: hòa tan 20mg stigmasterol trong 100ml MeOH. Các dịch được lắc siêu âm 5 phút để hoà tan, sau đó lọc qua màng lọc 0,45µm trước khi bơm vào máy. ...