Xây dựng quy trình giải trình tự cDNA gen APC

Gen APC (tumor - supresor adenomatous polyposis coli gene) là một gen ức chế khối u có 15 exon nằm tại vị trí 5q21-q22, mã hóa protein gồm 2843 acid amin. Các đột biến dòng mầm gây mất chức năng của protein APC làm β-catenin tích tụ trong tế bào và đi vào nhân, kích hoạt yếu tố phiên mã hoạt động, kích thích sự tăng sinh mất kiểm soát của tế bào dẫn đến ung thư.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Xây dựng quy trình giải trình tự cDNA gen APCY Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 19 * Số 5 * 2015 Nghiên cứu Y học XÂY DỰNG QUY TRÌNH GIẢI TRÌNH TỰ cDNA GEN APC Đoàn Nam Khánh*, Lê Minh Khôi**, Nguyễn Thị Băng Sương**TÓM TẮT Giới thiệu: Gen APC (tumor - supresor adenomatous polyposis coli gene) là một gen ức chế khối u có 15exon nằm tại vị trí 5q21-q22, mã hóa protein gồm 2843 acid amin. Các đột biến dòng mầm gây mất chức năngcủa protein APC làm β-catenin tích tụ trong tế bào và đi vào nhân, kích hoạt yếu tố phiên mã hoạt động, kíchthích sự tăng sinh mất kiểm soát của tế bào dẫn đến ung thư. Mục tiêu: Xây dựng quy trình giải trình tự cDNA gen APC. Đối tượng và phương pháp: RNA tổng số được tách chiết bằng chloroform, isopropanol có bổ sung isogenvà tổng hợp thành cDNA bằng phương pháp MMLV – RT. Sử dụng 10 cặp mồi để khuếch đại 15 exon của genAPC và giải trình tự bằng máy tự động. Kết quả được phân tích bằng phần mềm chuyên dụng. Kết quả: Xây dựng thành công quy trình giải trình tự cDNA gen APC với nhiệt độ bắt cặp tối ưu là 61oC,độ nhạy của quy trình là 5 ng/ μL. Sản phẩm giải trình tự tương đồng với trình tự gen APC. Kết luận: Xây dựng thành công quy trình giải trình tự cDNA gen APC. Từ khóa: Gen APC, khuếch đại gen, quy trình giải trình tự.ABSTRACT ESTABLISH THE PROTOCOL FOR AMPLIFICATION AND SEQUENCING OF APC GENE Doan Nam Khanh, Le Minh Khoi, Nguyen Thi Bang Suong * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement of Vol. 19 - No 5 - 2015: 189 - 193 Introduction: APC (adenomatous polyposis coli) is a tumor suppressor gene. It contains 15 exons located at5q21-q22. The 2843 amino-acid APC protein plays an important role in regulating the Beta-catein growth signalfactor. Mutations in APC gene make Beta-catenin accumulate and translocate from the cytoplasm to the nucleus,where it might serve as a transcriptional factor to stimulate tumour formation. Aim: Establish the protocol for sequencing cDNA APC gene. Materials and Methods: RNA was extracted by chloroform, isopropanol anh isogen. cDNA synthesizedusing MMLV –RT method. Fifteen exons of APC gene were ampliflied and sequenced using 10 pairs of primerand ABI system, respectively. Results were analysed with professsional software. Results: PCR for amplifying 15 exons of APC gene was optimized with annealing temperature at 61oC andthe method has sensitivity of 5 ng /μL. Sequenced products are identical to standard sequence database of APCgene from NCBI genbank. Conclusion: We have successfully established the protocol for amplifying and identifying all sequences ofAPC gene. Key words: APC gene, RT-PCR, sequencing protocol.ĐẶT VẤN ĐỀ nằm tại vị trí 5q21-q22, trong đó exon 15 có kích thước rất lớn, bao gồm 6574 bp (base Gen APC (adenomatous polyposis coli gene) là pair), chiếm 75% của trình tự mã hóa protein.một gen ức chế khối u có tổng cộng 15 exon * Khoa Sinh học, Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh ** Đại học Y Dược Tp Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: PGS.TS. Nguyễn Thị Băng Sương ĐT: 0913281386 Email: suongnguyenmd@gmail.comChuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 189Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 19 * Số 5 * 2015Sản phẩm dịch mã của gen là protein APC, tiến hành nghiên cứu xây dựng quy trình giảigồm 2843 acid amin, kích thước khoảng 310 trình tự gen này.kDa. Protein APC tham gia vào phức hợp ĐỐI TƯỢNG-PHƯƠNGPHÁP NGHIÊNCỨUphân hủy β-catenin. Các đột biến dòng mầmlàm mất chức năng của protein APC sẽ làm β- Đối tượng nghiên cứucatenin tích tụ trong tế bào và đi vào nhân, Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiếnkích hoạt yếu tố phiên mã TCF/LEF hoạt động, hành giải trình tự cDNA gen APC của 10 ngườikích thích sự tăng sinh mất kiểm soát của tế bình thường khỏe mạnh. Nội soi đại trực tràngbào dẫn đến ung thư5,1,4. Người mang gen không phát hiện polyp.APC bị đột biến sẽ mắc bệnh đa polyp tuyến Phương pháp nghiên cứugia đình (hereditary familial adenomatous Tách chiết RNA tổng số từ mẫu máupolyposis: FAP) – là căn bệnh di truyền với biểuhiện lâm sàng là sự xuất hiện hàng trăm đến Máu ngoại vi khi thu nhận được giữ tronghàng ngàn polyp trong đại trực tràng, nếu ống chống đông bằng EDTA và được ly tríchkhông được điều trị thì 100% bệnh nhân sẽ bị trong vòng 24 giờ. Sử dụng quy trình tách chiếtung thư đại trực tràng. Bên cạnh nguy cơ ung RNA tổng số bằng c ...