Xây dựng quy trình PCR điện di phát hiện virut gây hội chứng viêm đường hô hấp cấp trung đông

Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm thiết lập phương pháp PCR phiên mã ngược phát hiện virut gây hội chứng viêm đường hô hấp cấp Trung Đông (MERS-CoV). Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết của tài liệu.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Xây dựng quy trình PCR điện di phát hiện virut gây hội chứng viêm đường hô hấp cấp trung đôngTẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2014XÂY DỰNG QUY TRÌNH PCR ĐIỆN DI PHÁT HIỆN VIRUTGÂY HỘI CHỨNG VIÊM ĐƢỜNG HÔ HẤP CẤP TRUNG ĐÔNGNgô Tất Trung*; Trần Thị Thu Hiền*; Phan Quốc Hoàn*; Lê Hữu Song*TÓM TẮTĐặc điểm lâm sàng của chứng viêm đường hô hấp cấp Trung Đông (Middle East respiratorysyndrome gây ra bởi Middle East respiratory syndrome coronavirus MERS-CoV) dễ nhầm vớihội chứng viêm đường hô hấp cấp (Severe acute respiratory syndrome - SARS). Tại thời điểmhiện tại, chúng ta chưa có công cụ chẩn đoán phát hiện tác nhân gây bệnh nguy hiểm này.Thiết lập quy trình PCR điện di phát hiện virut gây hội chứng MERS-CoV. Phần mềm Invitrogenevector NTI-11.2 và các bệnh phẩm chuẩn âm được thu thập tại Bệnh viện TWQĐ 108. Tổng hợpcADN phiên mã ngược và PCR điện di một vòng. Kết quả cho thấy bộ mồi SHPT108@MERSCoV-L, SHPT108@MERS-CoV-S hoàn toàn có khả năng phát hiện sự có mặt các đoạn ARNcoronavirus ở mật độ 1 copy ARN virut/1.000 copy ARN đối chứng, đồng thời không tạo rabăng PCR phụ và không bắt cặp chéo vào các khu vực có tính tương đồng thấp của hệ genngười. Kết luận: kỹ thuật PCR điện di phát hiện ARN coronavirus đã được thiết kế thành công.* Từ khóa: Hội chứng viêm đường hô hấp cấp Trung Đông; Betacoronarivus.ESTABLISH A PCR ASSAY FOR DIAGNOSING MIDDLE EASTRESPIRATORY SYNDROME BETA-CORONAVIRUSSUMMARYMiddle East respiratory syndrome is clinically similiar to severe acute respiratory syndrome(SARS) hence, but the tool to differentiate the two diseases is unavailable at the moment. Theaim of this study is to build up a simple screening procedure for beta-coronavirus (MERS-CoV).The reverse transcriptase followed by polymerase chain reaction (PCR): Results shown that thetwo primer set SHPT108@MERS-CoV-L, SHPT108@MERS-CoV-S were optimized that allowto detect presence of one betacoronavirus RNA copy out of 1,000 ABL RNA copies without anymis-amplification from MERS-CoV free samples.* Key words: Middle East respiratory syndrome; Betacoronavirus.ĐẶT VẤN ĐỀHội chứng viêm đường hô hấp cấp TrungĐông (gây ra bởi Middle East respiratorysyndrome coronavirus [MERS-CoV]). Đâylà một ARN betaconarvirus có đặc điểm ditruyền học rất gần với virut gây hội chứngviêm đường hô hấp cấp (SARS). Virut nàyđược bác sĩ Ali Moh Zaki - một nhà viruthọc người Ai Cập phân lập lần đầu tiên từ1 bệnh nhân (BN) 60 tuổi suy thận kèmviêm phổi cấp, BN này sau đó tử vong [1].* Bệnh viện TWQĐ 108Người phản hồi (Corresponding): Ngô Tất Trung (ntattrung@yahoo.com)Ngày nhận bài: 23/05/2014; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 03/07/2014Ngày bài báo được đăng: 23/09/201450TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2014Cho đến nay, bộ gen của MERS-CoV(còn được gọi với tên khác là HCoVEMC/2012) đã được giải trình tự hoàntoàn, nó bao gồm 30.119 nucleotide và chứakhoảng 10 khung đọc mở (open readingframes). Phân tích phả hệ dựa trên gencoronaviruses replicase cho thấy MERSCoV có đặc điểm di truyền học rất gần vớiTylonycteris bat coronavirus HKU4 (BtCoVHKU4) và Pipistrellus bat coronavirus HKU5(BtCoV-HKU5) khu trú trên dơi.Trước kia, người ta cho rằng coronaviruscó khả năng xâm nhiễm vào cả người vàđộng vật, gây ra các biến chứng khôngquá trầm trọng. Tuy nhiên, sự bùng phátcủa virut gây hội chứng viêm đường hôhấp cấp SARS-CoV vào năm 2002 - 2003và HCoV-EMC/2012 vào năm 2012 chothấy coronavirus thật sự có khả năng gâybệnh nặng, thậm chí gây tử vong cho người[2]. Theo Cơ quan Kiểm soát bệnh Hoa Kỳ(Center For Disease Control - CDC), tínhđến tháng 4 năm 2014) đã có 618 BNdương tính và 192 BN tử vong do MERSCoV, đa số được phát hiện tại các nướcchâu Âu và Ả Rập [3]. Đặc biệt, một sốnước châu Á nằm gần Việt Nam nhưMalaysia hay Philippines đã ghi nhậnnhững trường hợp dương tính và tử vongđầu tiên [7].Việt Nam chưa ghi nhận trường hợpnào nhiễm MERS-CoV, tuy nhiên, đây làchủng virut có độc lực mạnh, có khả nănglây nhiễm từ người sang người, vì thế,việc chẩn đoán sớm và chính xác tác nhânnày là điều cần làm. Hơn nữa, chưa cócơ sở y tế nào công bố thiết lập phươngpháp chẩn đoán chủng virut này.51Mục tiêu của nghiên cứu nhằm: Thiết lậpphương pháp PCR phiên mã ngược pháthiện virut gây hội chứng viêm đường hôhấp cấp Trung Đông (MERS-CoV).VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁPNGHIÊN CỨU1. Vật liệu nghiên cứu.- Các đoạn ARN mã hóa cho một phầnbộ gen (MERS-CoV), phân lập từ dịch phếquản BN và được lưu trữ tại Trung tâm Lưutrữ virut châu Âu (European Virus Archive EVA), do Tiến sỹ Tobias Bleicker tặng KhoaSinh học phân tử, Bệnh viện TWQĐ 108.- Máy Thermocycler Eppendorff (Hamburg,CHLB Đức).- Máy chụp hình gel (EC3 imagingsystem Mỹ).- Phần mềm Invitrogene vector NTI-11.2.- Hóa chất: Tris-base, taq-polymerase,Trizol (Sigma, Mỹ).- Các bệnh phẩm huyết thanh dươngtính với HBV, HCV, mẫu cADN bạch cầutủy mạn được thu thập tại Bệnh viện TWQĐ108 và các sinh phẩm chuẩn cho thí nghiệmsinh học phân tử.2. Phương pháp nghiên cứu.Mẫu ARN chuẩn dương và ARN bệnhphẩm được dùng làm khuôn cho phảnứng phiên mã ngược tổng hợp cADN bổsung. cADN này lại được dùng cho phảnứng PCR điện di, với 2 cặp mồi đặc hiệucho khu vực mã hóa đầu nguồn (upstreamcoding region) của HCoV-EMC/2012. Đểtiện cho thảo luận sau này, chúng tôi gọiđó là bộ mồi SHPT108@MERS-CoV-L vàSHPT108@MERS-CoV-S) với trình tự sau:TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2014SHPT108@MERS-CoV-LUpE-Fwd2GTGCCTGCAACGCGCGATTCAGTTUpE-Rev2GATTAGCCTCTACACGGGACCCATAGSHPT108@MERS-CoV-SORF1b-FwdTTCGATGTTGAGGGTGCTCATORF1b-RevTCACACCAGTTGAAAATCCTAATTGKẾT QUẢ NGHIÊN CỨU1. Khả năng phát hiện của bộ mồi SHPT108@MERS-CoV-L và SHPT108@MERSCoV-S.Theo hướng dẫn chẩn đoán cúm mới nhất do Tổ chức Y tế Thế giới ban hành, để khẳngđịnh sự tồn tại của một chủng virut cúm trong mẫu bệnh phẩm, cần thực hiện 2 phảnứng PCR với 2 mồi khác biệt. Vì thế, chúng tôi thiết kế và thử nghiệm hai cặp mồi khácnhau SH ...