Xây dựng quy trình xác định hoạt tính sinh học của interferon alpha gà (ChIFN-α)

Quy trình xác định hoạt tính sinh học của interferon alpha gà (ChIFN-α) được xây dựng dựa trên quy trình xác định hiệu giá của interferon alpha 2. Các thông số chính sử dụng trong quy trình bao gồm: mật độ tế bào UMNSAH/ DF1 (dòng nguyên bào sợi phôi gà) là 4 ˟ 105 tế bào/ml (4 ˟ 104 tế bào/giếng/100 µl); virus sử dụng để đánh giá là NDV (Newcastle disease virus) liều 100 TCID50/0,1 ml. Kết quả thử nghiệm cho thấy, quy trình xác định hoạt tính sinh học của ChIFN-α có tính ổn định cao khi áp dụng hai loại virus khác nhau (NDV và VSV - Vesicular stomatitis virus). Kết quả đạt được có sai số nằm trong khoảng cho phép của Bộ Y tế (hiệu giá sai số cho phép nằm trong khoảng 70 - 150%).
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Xây dựng quy trình xác định hoạt tính sinh học của interferon alpha gà (ChIFN-α) Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 2(111)/2020 XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA INTERFERON ALPHA GÀ (ChIFN-α) Nguyễn Thị Thanh Giang1, Nguyễn Đăng Quân1, Hồ Quảng Đồ2 TÓM TẮT Quy trình xác định hoạt tính sinh học của interferon alpha gà (ChIFN-α) được xây dựng dựa trên quy trình xácđịnh hiệu giá của interferon alpha 2. Các thông số chính sử dụng trong quy trình bao gồm: mật độ tế bào UMNSAH/DF1 (dòng nguyên bào sợi phôi gà) là 4 ˟ 105 tế bào/ml (4 ˟ 104 tế bào/giếng/100 µl); virus sử dụng để đánh giá làNDV (Newcastle disease virus) liều 100 TCID50/0,1 ml. Kết quả thử nghiệm cho thấy, quy trình xác định hoạt tínhsinh học của ChIFN-α có tính ổn định cao khi áp dụng hai loại virus khác nhau (NDV và VSV - Vesicular stomatitisvirus). Kết quả đạt được có sai số nằm trong khoảng cho phép của Bộ Y tế (hiệu giá sai số cho phép nằm trongkhoảng 70 - 150%). Từ khóa: Interferon alpha gà, hoạt tính sinh học, bệnh tích tế bào, liều gây nhiễm 50% tế bào thử nghiệmI. ĐẶT VẤN ĐỀ Thú y, Khoa Nông nghiệp, Đại học Cần Thơ), virus Interferon alpha gà (ChIFN-α) đã được chứng VSV (Viện Vaccine và Sinh phẩm y tế Nha Trang).minh có khả năng ức chế các virus gây bệnh Hóa chất: dịch ChIFN-α (Trung tâm Công nghệNewcastle (Hou et al., 2011), Gumboro (Mo et al., Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh); ChIFN-α chuẩn2001), cúm H1N1, H5N9 (Jiang et al., 2011), bạch (Biorad); trypsin (Sigma); MTT (Sigma); DMEMcầu sarcoma ở gia cầm (Dai et al., 2016), virus gây (Sigma); FBS (Sigma); PBS (Gibco); Trypan bluebệnh mụn giộp (VSV, Vesicular stomatitis virus) (Sigma).(Hou et al., 2011). Hơn nữa, interferon (IFN) còn 2.2. Phương pháp nghiên cứukích thích miễn dịch đặc hiệu do đó thường được sửdụng như là một tác nhân hỗ trợ, nhằm tăng cường 2.2.1. Xác định mật độ tế bào thích hợp đưa lên giếnghiệu quả phòng ngừa và điều trị bệnh do virus ở Tế bào đơn UMNSAH/DF1 được xác định mậtngười, gia cầm và kèm với vaccine liều thấp nhằm độ thích hợp, đưa lên đĩa nuôi cấy tế bào 96 giếngtăng cường hiệu quả của vaccine (González-Navajas chuẩn bị cho thử nghiệm. Môi trường nuôi tế bàoet al., 2012). Trước nhu cầu thực tế, trong việc phòng là DMEM 2% FBS, nhằm giúp các tế bào duy trì sựngừa và điều trị các bệnh do virus gây ra ở gia cầm sống và hầu như không tăng sinh trong thời gian dàitại Việt Nam, Trung tâm Công nghệ Sinh học thành nuôi cấy. Tế bào UMNSAH/DF1 được đưa lên đĩaphố Hồ Chí Minh đã tạo được chế phẩm interferon 96 giếng, với thể mỗi giếng 0,1 ml/giếng, mật độ tếalpha gà (ChIFN-α) tái tổ hợp biểu hiện từ nấm men bào khảo sát: 1 ˟ 105 tế bào/ml, 2 ˟ 105 tế bào/ml,Pichia pastoris. Tuy nhiên, để có thể được thương 4 ˟ 105 tế bào/ml và 8 ˟ 105 tế bào/ml (mỗi nồng độmại, yêu cầu thiết yếu trong quy trình sản xuất là tế bào thực hiện trên 32 giếng). Quan sát hình thái tếcác chế phẩm này cần phải được xác định hoạt tính bào trong các giếng sau 24 giờ nuôi cấy.của chế phẩm. Tuy nhiên, quá trình xác định hoạt 2.2.2. Chuẩn độ virus xác định liều gây nhiễmtính của ChIFN-α còn gặp nhiều khó khăn do trong 50% tế bào nuôi cấy (TCID50/ml, Tissue Culturenước chưa có đơn vị kiểm định mẫu ChIFN-α, mà Infectious Dose 50%/ml)một số đơn vị chỉ nhận mẫu kiểm định là interferon Quy trình chuẩn độ virus được tiến hành theongười (hIFN). Do vậy, nghiên cứu được tiến hành phương pháp của Hussain và Rasool (2005) và chỉ sốnhằm có được quy trình thường quy xác định hoạt TCID50/0,1 ml được tính toán theo công thức củatính sinh học (IU/mg) của ChIFN-α áp dụng trong Reed Muench (1938) dựa trên biểu hiện bệnh tích tếphòng thí nghiệm. bào (CPE, cytopathic effect). Tế bào UMNSAH/DF1II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU trong đĩa 96 giếng với mật độ tế bào ban đầu là 4 ˟ 104 tế bào/giếng được nuôi cấy trong 24 giờ ở2.1. Vật liệu nghiên cứu 37oC, 5% CO2. Lớp đơn tế bào UMNSAH/DF1 này Nguồn mẫu: Dòng tế bào UMNSAH/DF1 được cho tiếp xúc (lây nhiễm) với 100 μl dịch huyền(ATCC), v ...