bài giảng công nghệ sinh học đại cương 1 phần 3

Một số phương pháp đưa DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ 2.4.1- Hóa biến nạp Hiện tượng biến nạp là chìa khóa giúp ta hiểu biết cơ sở phân tử của gen, cũng là công cụ để thực hiện các thao tác tạo tính di truyền của vật sống. Theo Mandel và Higa cho thấy rằng, E. Coli trở nên rất dễ bị biến nạp bởi DNA ngoại lai khi các tế bào vi khuẩn được xử lí trong môi trường có CaCl2 và trước đó...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
bài giảng công nghệ sinh học đại cương 1 phần 3 5 3 GGA T C C Plasmid chøa chuçi 5 3 C C T A GG ®Ých cña BamHI C¾t DNA b»ng E exonuclease 5 3 C¾t b»ng E BamHI 3 5 5 3 (3’) GA T C C G G C C T A G (3’) PolyC ETT PolyGCCC ETT CCC (3’) GGGGGA T C C G C C T A GGGGG (3’) G GGGGGA T C C CCC G CCC G C C T A GGGGG BamHI BamHI GGGG G A T C C GGA T C C C C C C C T A G G GGG C C C C C T A GG DNA t¸i tæ hîp Linker Linker DNA l¹Hình 2-6: Cách tạo DNA tái tổ hợp dùng enzyme terminal transferase2.4- Một số phương pháp đưa DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ2.4.1- Hóa biến nạp Hiện tượng biến nạp là chìa khóa giúp ta hiểu biết cơ sở phân tử của gen,cũng là công cụ để thực hiện các thao tác tạo tính di truyền của vật sống. TheoMandel và Higa cho thấy rằng, E. Coli trở nên rất dễ bị biến nạp bởi DNA ngoạilai khi các tế bào vi khuẩn được xử lí trong môi trường có CaCl2 và trước đó đượcsốc nhiệt ở 42°C. Hóa biến nạp là phương pháp sử dụng chất hóa học, tạo điều kiện để đưavector tái tổ hợp vào tế bào chủ. Quá trình được thực hiện theo hai buớc sau: Xử lítế bào chủ trong dung dịch CaCl2 ở nhiệt độ thấp nhằm để thay đổi màng tế bào vàủ vector tái tổ hợp với tế bào chủ đã xử lí. Hiệu suất của phương pháp hóa biến nạp này vào khoảng 105 đến 106 tế bàobiến nạp trên 1mg DNA tái tổ hợp. Qua các kết quả thực nghiệm, người ta thấyrằng, các tế bào phát triển ở pha sớm đến pha giữa dễ được biến nạp hơn. Nhữngnghiên cứu sau này cho thấy việc xử lí tế bào bằng các ion kim loại hóa trị hai nhưMg+2, Mn+2 và Ba+2 cũng cho khả năng biến nạp lớn. Ngoài ra, hiệu suất biến nạpcòn phụ thuộc vào kích thước của plasmid, plasmid càng nhỏ thì hiệu suất biếnnạp càng cao.2.4.2- Điện biến nạp Nguyên tắc: Sử dụng dòng điện cao thế cục bộ theo xung để tạo lỗ nhỏ trênmàng sinh học của tế bào, tạo điều kiện cho tế bào hấp thụ DNA tái tổ hợp đượcdễ dàng. Hiệu suất: Từ 109 đến 1010 tế bào biến nạp cho 1mg DNA tái tổ hợp, tuynhiên, lượng tế bào biến nạp bị chết nhiều có khi lên tới 70%. Hiệu suất củaphương pháp này phụ thuộc vào các yếu tố sau: - Độ mạnh của điện trường tác động khác nhau đối với các loại tế bào khácnhau, - Độ dài của hằng số thời gian (thời gian ngắt xung - ms). Theo nhiều nghiêncứu, hầu hết đối với các loại tế bào sinh vật, hiệu quả biến nạp cao khi hằng sốthời gian đạt được khoảng 6ms, - Nồng độ tế bào chủ, - Nồng độ DNA tái tổ hợp, - Giai đoạn phát triển của tế bào (tế bào quá già hoặc quá non đều không thíchhợp), - Môi trường dung dịch đệm, - Cấu trúc màng tế bào.2.4.3- Biến nạp tế bào trần (p rotoplast) Là phương pháp chuyển DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ đã được xử lí bằngpolyetylen glycol (PEG). Để tạo tế bào trần, người ta ủ tế bào với PEG nồng độ30% đến 40%. Đây là phương pháp chuyển gen có hiệu quả cao đối với tế bàothực vật. Bằng phương pháp này, người ta đã nhận được các cây mang gen biếnnạp ổn định và di truyền qua nhiều thế hệ (Potrykus và cộng sự - 1995). Ưu điểm: Tần số biến nạp đồng thời gen chỉ thị và gen cần biến nạp cao.Có thể chuyển gen vào tế bào protoplast của bất kỳ loại cây nào. Đặc biệt là loạicây có giá trị kinh tế cao như lúa, ngô, đại mạch. Nhược điểm: Việc tái sinh cây protoplast còn rất khó khăn ở một số loàicây.2.4.4- Phương pháp bắn gen Nguyên tắc: Người ta sử dụng hạt kim loại nặng được bao bọc DNA và bắntrực tiếp vào tế bào. Ưu điểm: Phương pháp này có thể biến nạp cho tất cả các loại tế bào thựcvật. Thao tác dễ dàng, bắn một lần được nhiều tế bào. Nhược điểm: Hiệu suất biến nạp thấp, thường xuyên nhận được cây biếnnạp khảm (cây có tế bào biến nạp và tế bào không biến nạp). Một số thành tựu đã đạt đ ...