Bài giảng Công nghệ sinh học đại cương: Chương 2 - Nguyễn Thị Phương Thảo

Bài giảng "Công nghệ sinh học đại cương - Chương 2: Các kỹ thuật nền của CNSH hiện đại" cung cấp cho người học các kiến thức: Khái niệm thư viện DNA, phân loại thư viện mẫu, kỹ thuật tạo thư viện cDNA. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Bài giảng Công nghệ sinh học đại cương: Chương 2 - Nguyễn Thị Phương Thảo Chương II. Các kỹ thuật nền của CNSH hiện đại dd Chức năng và ứng dụng của các enzyme giới hạn Giới thiệu các vector nhân dòng và kỹ thuật nhân dòng gen Phương pháp PCR Các phương pháp lai phân tử (lai Southern, Northern, Western) Kỹ thuật xác định trình tự DNA Kỹ thuật tạo thư viện DNA Khái niệm thư viện DNA•Thư viện DNA, giống như thư viện truyền thống được sửdụng để thu thập và lưu trữ thông tin•Trong thư viện DNA thống tin được dự trữ là các phân tửDNA Th- viÖn DNA lµ tËp hîp ngÉu nhiªn c¸c ®o¹n ADN (cã tÝnh ®¹i diÖn ®Æc thï cho hÖ gen cña mét sinh vËt) ®-îc chÌn vµo c¸c vector nh©n dßng Cã hai lo¹i th- viÖn mÉu chÝnh ®ã lµ:1. Th- viÖn genom (Genomic library): chøa toµn bé c¸c ®o¹n DNA cã trong nh©n cña mét tæ chøc hay c¬ thÓ. Genomic library cã thÓ ®-îc nh©n dßng b»ng plasmid hoÆc genome cña thùc khuÈn thÓ.2. Th- viÖn cDNA (cDNA library): chøa c¸c ®o¹n cDNA cã tÝnh ®¹i diÖn ®Æc thï cho toµn bé mARN cña mét m«. Th- viÖn cDNA ®-îc t¹o ra b»ng c¸ch tæng hîp nªn cDNA tõ mRNA. C¸c b-íc trong t¹o th- viÖn mÉu ®· nh©n dßng1. T¹o c¸c ®o¹n ADN ngÉu nhiªn tõ hÖ gen hay cDNA2. ChÌn c¸c ®o¹n ADN vµo vect¬ nh©n dßng thÝch hîp.3. Nh©n c¸c ®o¹n ADN t¹o ra trong hÖ thèng tÕ bµo chñ (chøa vect¬ nh©n dßng t-¬ng øng)4. Chän läc c¸c dßng cã chøa vect¬ mang ®o¹n ADN môc tiªu.Thiết kế thưviện mẫu chođọc trình tự. Mçi mét ®o¹n ADN cµi trong mét vect¬ biÕn n¹p trong 1 tÕ bµo vi khuÈn  S¸ch (Book) TËp hîp tÊt c¸c c¸c dßng vi khuÈn Th- viÖn T¹o ®o¹n ADN cã kÝch th-íc phï hîp cho nh©n dßngKÝch th-íc cña ®o¹n ADN tïy thuéc vµo môc ®Ých sö dôngth- viÖn §Ó lËp b¶n ®å, x¸c ®Þnh c¸c gen hay t¸ch dßng gen tõ hÖ gen cã kÝch th-íc líncÇn c¸c ®oạn ADN lín vµ sö dông c¸c vect¬ nh- phage, cosmid, BAC hay YAC §Ó x¸c ®Þnh tr×nh tù, lËp b¶n ®å chi tiÕt... cÇn c¸c ®o¹n ADN cã kÝch th-íc nhá, sö dông vect¬ nh©n dßng lµ plasmid C¸c ®o¹n ADN ph¶i cã tÝnh ngÉu nhiªn ®Ó ®¶m b¶o tÝnh ®¹i diÖn cho hÖ gen. T¹o ®o¹n ADN cã kÝch th-íc phï hîp cho nh©n dßng Lµm g·y nhiÔm s¾c thÓ Cắt bằng RE  Ở genom người dùng RE cã vïng nhËn biÕt gåm 8 Nu (Not1, SfiI) sẽ tạo được đoạn cắt có chiều dài lớn  Thông thường dùng RE cã vïng nhËn biÕt gåm 4 Nu AluI, HaeIII cắt kh«ng hoµn toµn (partial digest) bằng cách sử dụng phối hợp nhiều RE Bảng. Khả năng chèn đoạn ADN ngo¹i lai của một số vectơ nhân dòng Khả năng chứa đoạnStt Vectơ ADN(kb) Plasmit Trong mét th- viÖn sẽ chứa bao nhiªu dßng ?Theo lý thuyÕt: Sè dßng tèi thiÓu cÇn thiÕt ®Ó t¹o th- viÖn(n) = ®é lín cña hÖ gen (b) ®é lín TB cña ®o¹n ADN (a) VÝ dô: thiÕt kÕ th- viÖn hÖ gen cña ng-êi, dïng c¸c vector kh¸c nhau: KÝch th-íc genome : 3 x 109 bp Plasmid = Take inserts of 0.2 - 20 kb (kb = kilobase = 1000 bases)--- > Average insert size of 1000 bases = 3 x 106 clones required to cover one human genome (haploid human) Lambda Phage = Inserts of 9-23 kb ---> Average insert of 17,000 bases = 1.8 x 105 clones required to cover one human genome Cosmid = Take inserts of 35-50 kb ---> Average insert of 50,000 bases = 60,000 clones required to cover one human genome BAC (bacterial artificial chromosome) =Take inserts of ~500 kb ---> Average insert of 500 kb= 6,000 clones required to cover one human genome YAC (yeast artificial chromosomes) = Take inserts of 200 kb - 1 Mb (Mb = 1 x 106 bases) or greater --> Average insert of 1 Mb = 3,000 clones required to cover one human genomeTrªn thùc tÕ, sè dßng sÏ lín h¬n bëi qu¸ trìnhc¾t vµ ghÐp vµo vector lµ ngÉu nhiªn.  Mét sè dßng sÏ cã mÆt h¬n mét lÇn trong th- viÖn do hiÖn t-îng lÆp ®o¹n  Mét sè trình tù nµo ®ã sÏ bÞ mÊt nÕu chØ sö dông sè dßng tèi thiÓu.  Clarke and Carbon (1976) ®Ò nghÞ c«ng thøc tÝnh míi nh»m tÝnh x¸c suÊt ®Ó mét ®o¹n ADN ®-îc nh©n dßng trong mét th- viÖn mÉu. N= ln(1-P) ln(1-a/b)  Trong ®ã: P: x¸c xuÊt nh©n dßng mét ®o¹n DNA bÊt kú; a: kÝch th-íc ®o¹n DNA cÇn nh©n (bp), b : ®é lín hÖ gen (bp) Câu hỏi Cần bao nhiêu dòng để 99 % một đoạn trình tự có mặt trong thư viện gen của người sử dụng cosmid vector? The Central Dogma exonDNA Double-stranded intronPrecursor AAAAAAAAAAn RNAmRNA AAAAAAAAAAn Single-stranded Reverse transcri ...