Bài giảng Công nghệ sinh học đại cương: Chương 2 - Nguyễn Thị Phương Thảo (p3)

Bài giảng "Công nghệ sinh học đại cương - Chương 2: Các kỹ thuật nền của CNSH hiện đại" cung cấp cho người học các kiến thức về: Kỹ thuật xác định trình tự DNA, kỹ thuật tạo thư viện hệ gen và cDNA. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Bài giảng Công nghệ sinh học đại cương: Chương 2 - Nguyễn Thị Phương Thảo (p3) Chức năng và ứng dụng của các enzyme giới hạn Giới thiệu các vector nhân dòng và kỹ thuật nhân dòng gen Phương pháp PCR Các phương pháp lai phân tử (lai Southern, Northern, Western) Kỹ thuật xác định trình tự DNA Kỹ thuật tạo thư viện hệ gen và cDNA 2Nguyễn Thị Phương Thảo ,Bộ Môn CNSH Thực Vật, Khoa CNSH, ĐHNNHN Khái niệm•Xác định trình tự ADN là việc xác định trình tự sắp xếp cácnucleotides trong một đoạn DNA.C¸c mèc gi¶i m· hÖ gen cña c¸c sinh vËt kh¸c nhau http://www.genomesonline.orgCác phương pháp xác định trình tự Maxam-Gilbert method (1977) Sanger method (1977) Automated sequencing Next generation sequencing 6Nguyễn Thị Phương Thảo ,Bộ Môn CNSH Thực Vật, Khoa CNSH, ĐHNNHNNguyên tắc: Nếu chúng ta biết khoảng cách của mỗi loại base từ mộtnguồn gốc đã biêt, thì có thể suy ra trình tự của DNAThí dụ nếu ta biết:A ở vị trí 2, 3, 11, 13 ...G ở vị trí 1, 12, ...C ở vị trí 6, 7, 8, 10, 15...T ở vị trí 4, 5, 9, 14....Thì có thể suy ra trình tự đoạn DNA ban đầu là: GAATTCCCTCAGTCĐể có đuợc các thông tin này, có thể tạo ra một vị trí kết thúc của mộtđoạn DNA đang kéo dài tại một base đã biêt (A, T, C hoặc G) và ở mộtvị trí đã biết trên DNA 7 Nguyễn Thị Phương Thảo ,Bộ Môn CNSH Thực Vật, Khoa CNSH, ĐHNNHN Maxam-Gilbert Method• Là phương pháp phân giải hóa học•Sử dụng hóa chất để phân hủy ADN ở các vị trí baseđặc hiệu tạo ra các đoạn có chiều dài khác nhauCác loại hóa chất sử dụng Dimethyl sulfat methyl hóa G. Axit formic pH=2 gây biến đổi và loại A + G. Hydrazin gây biến đổi tại C và T. Hydrazin + NaCl nồng độ cao gây biến đổi tại C. Piperidine được dùng để loại bỏ các base sau khi bị biến đổi và cắt mạch. Chemical used for Chemical used Base Chemical used for altered base for strandspecificity base alteration removal cleavage G Dimethylsulphate Piperidine Piperidine A+G Acid Acid Piperidine C+T Hydrazine Piperidine Piperidine C Hydrazine + alkali Piperidine Piperidine A>C Alkali Piperidine PiperidineJ2 nucleic acid sequencing Maxam and Gilbert chemical method DNA labeled at one end with 32P G C T G C T A Base modification G C T G C T A CH3 Release or displace- ment of reacted bases G C T C T A Strand scission G C T C T A Các bước tiến hành Chuỗi ADN kép được đánh dấu phóng xạ với phosphorus (32P) ở đầu 5. Sử dụng Polynucleotide kinase enzyme và 32P- dATP. Dùng dimethyl sulphoxide và đun nóng đến 90oC, 2 mạch của ADN tách nhau ra và được tinh chế lại (e.g. dùng điện di trên gel và dựa trên nguyên tắc 1 mạch của ADN chắc chắn sẽ nặng hơn mạch kia bởi có chứa nhiều purine nucleotides (A and G) hơn than pyrimidines (C and T) vốn nhẹ hơn). Các sợi đơn được chia thành các mẫu riêng rẽ và được sử lý với các hóa chất đặc hiệu, chỉ gây biến đổi 1 trong 4 base,Xö lý tiÕp c¸c mÉu nµy víi piperidin ®Ó bÎ gÉy ADN t¹i vÞ trÝ baz¬ nit¬ ®· bÞ thay đổi t¹o ra c¸c ®o¹n oligonucleotid cã chiÒu dµi h¬n kÐm nhau mét nucleotid ĐiÖn di riªng rÏ 4 mÉu trªn cïng 1 gel ®iÖn di, lµm phim phãng x¹ tù ghi và ®äc vÞ trÝ cña c¸c nucleotit lÇn l-ît trªn 4 mÉu tõ cùc d-¬ng cña gel lªn cùc ©m theo nguyªn t¾c: ®o¹n ADN cµng ng¾n cµng dÞch chuyÓn xa so víi ®iÓm xuÊt ph¸t ban ®Çu trªn b¶n ®iÖn di ®å.§¸nh dÊu phóng x¹ Sîi kÐp ADN Sîi ®¬n ADN T¹o tËp hîp chØ 1 sîi ®¬n cÇn ®oc tr×nh tù, chia vµo 4 èng Ph¸ huû ®Æc hiÖu chØ 1 lo¹i baz¬ ...