Bài giảng Công nghệ sinh học đại cương: Chương 2 - ThS. Ninh Thị Thảo (Bài 2)

Bài giảng "Công nghệ sinh học đại cương - Chương 2: Các kỹ thuật nền của CNSH hiện đại (Bài 2)" cung cấp cho người học các kiến thức về các vector nhân dòng và kỹ thuật nhân dòng gen bao gồm: Nhân dòng DNA, vector nhân dòng DNA, tiêu chuẩn của một vector nhân dòng DNA,... Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Bài giảng Công nghệ sinh học đại cương: Chương 2 - ThS. Ninh Thị Thảo (Bài 2) CHƯƠNG II: CÁC KỸTHUẬT NỀN CỦA CNSH HIỆN ĐẠI (10 TIẾT) Chức năng và ứng dụng của các enzyme giới hạn Giới thiệu các vector nhân dòng và kỹ thuật nhân dòng gen Các phương pháp lai phân tử Phương pháp PCR, ứng dụng Kỹ thuật xác định trình tự DNA Kỹ thuật tạo thư viện genome và cDNA 8/26/2014 1 BM CNSH TV – Khoa CNSH Nhân dòng DNA• Nhân dòng DNA là kỹ thuật dùng để tái sản xuất các đoạn DNA.• Hai cách: ▪ sử dụng tế bào chủ ▪ dùng PCR• Một vector là yêu cầu cần thiết để mang đoạn DNA mục tiêu vào trogn tế bào chủ BM CNSH TV – Khoa CNSH Vector nhân dòng DNA Vector là các phân tử được dùng để mang các đoạn DNA/gen đã được tách dòng  Trong thực tế, một đoạn DNA lạ không thể duy trì và nhân bản trong tế bào chủ mới nếu như nó được chuyển vào tế bào chủ mới chỉ ở dạng một đoạn DNA đơn độc.  Do enzyme DNA polymerase làm nhiệm vụ tái bản DNA không thể khởi đầu quá trình tái bản từ bất kỳ địa điểm nào trên DNA mà chỉ ở những địa điểm đặc hiệu gọi là “điểm tái bản” (origins of replication)Các đoạn DNA (các gen) muốn tái bản được trong tế bào chủ mới cần phải được gắn vào một vectơ (cloning vectors).Vector nhân dòng thực chất là một phân tử DNA có gốc tái bản và có thể nhân lên trong tế bào chủ đã chọn. BM CNSH TV – Khoa CNSH Tiêu chuẩn của một vector nhân dòng• Chỉ có một địa điểm nhận biết cho một RE nào đó. – Nếu như số địa điểm này lớn hơn 1 sẽ gây rối loạn cho sự nhân dòng sau này. Một vector nhân dòng sẽ càng có ý nghĩa hơn nếu như nó có thể được cắt nhờ nhiều loại RE và tất nhiên ứng với mỗi loại cũng chỉ có một địa điểm nhận biết.• Phải có một hoặc nhiều chỉ thị di truyền chọn lọc – Thí dụ như tính kháng kháng sinh, tính xúc tác cho các phản ứng tạo mầu. Điều này cần thiết để có thể chọn lọc được các tế bào đã được chuyển nạp, dựa trên cơ sở kháng kháng sinh, tạo phản ứng mầu của chúng.• Phải có điểm tái bản để đảm bảo sự nhân lên của chúng trong tế bào chủ mới. – Trong một số trường hợp một plasmid có thể được sử dụng làm vector nhân dòng cho hai tế bào chủ không có liên quan với nhau như E.coli và Bacillus subtilis. Các vector hai chức năng này phải có số điểm tái bản lớn hơn 1. BM CNSH TV – Khoa CNSH Các loại vector nhân dòng DNA vectors Chromosome-basedPlasmid-based Virus-based YAC Phage-based MAC BAC Hybrid Eukaryotic virus- based (phagemid, cosmid …) BM CNSH TV – Khoa CNSH Các loại vector nhân dòng DNA• Các loại vector nhân dòng khác nhau được sử dụng cho các thí nghiệm nhân dòng khác nhau.• Việc lựa chọn vector phụ thuộc vào kích thưứoc và loại DNA cần nhân dòng BM CNSH TV – Khoa CNSHPlasmid• Các tế bào vi khuẩn có thể chứa các DNA ngoài DNA nhiễm Sắc thể gọi là các plasmid.• Plasmid thường ở dạng các DNA nhỏ mạch vòng.• Một số plasmid có mặt trong tế bào với nhiều bản sao. BM CNSH TV – Khoa CNSHƯu điểm của plasmid vectors:  Kích thước nhỏ (3-20kb)  Genome đã được giải mã  Số bản copy cao  thấp (1 – 10) hoặc cao (100 – 1000) copies/tế bào  Chứa gen chỉ thị hoặc chọn lọc  kanamycin resistance gene (kanR)  tetracycline resistance gene (tetR)  ampicillin resistance gene (ampR)  …. Chứa trình tự nhận biết duy nhất cho nhiều RE BM CNSH TV – Khoa CNSHMột số plasmid vector  pBR plasmid  pUC BM CNSH TV – Khoa CNSH Nhóm plasmid pBR 4363bp “p” : plasmid“BR” : tên của hai nhà khoa học F. Bolivar và R.Rodrigues“332”: số thứ tự. BM CNSH TV – Khoa CNSH Nhóm plasmid pUC• Đây là nhóm các plasmid được phát triển từ plasmid pBR322• Phần chứa gen kháng tetracyline (khoảng 40 % DNA) được cắt bỏ còn phần gen kháng ampicillin và gốc tái bản của pBR322 được giữ lại.• Ngoài ra, các vị trí nhân dòng hay vị trí gắn các đoạn ADN ngoại lai (cũng là các vị trí cắt của các enzym giới hạn) của pUC được phân bố tập trung vào một vị trí gọi là vị trí đa nhân dòng (multiple cloning site-MCS).Thành phần của một plasmid Older cloning vector• Gốc tái bản• Marker ch ...