Bài giảng Công nghệ sinh học đại cương: Chương 2 - ThS. Ninh Thị Thảo (Bài 5)

Bài giảng "Công nghệ sinh học đại cương - Chương 2: Các kỹ thuật nền của CNSH hiện đại (Bài 5)" cung cấp cho người đọc các kỹ thuật xác định trình tự DNA bao gồm: Khái niệm, các mốc giải mã hệ gen của các sinh vật khác nhau, phương pháp xác định trình tự,... Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Bài giảng Công nghệ sinh học đại cương: Chương 2 - ThS. Ninh Thị Thảo (Bài 5) CHƯƠNG II: CÁC KỸTHUẬT NỀN CỦA CNSH HIỆN ĐẠI (10 TIẾT)1. Chức năng và ứng dụng của các enzyme giới hạn2. Giới thiệu các vector nhân dòng và kỹ thuật nhân dòng gen3. Các phương pháp lai phân tử4. Phương pháp PCR, ứng dụng5. Kỹ thuật xác định trình tự DNA6. Kỹ thuật tạo thư viện genome và cDNA BM CNSH TV BM-CNSHTV – Khoa CNSHKỸ THUẬT XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ DNA BM-CNSHTVKhái niệmXác định trình tự DNA là phương pháp xác định trậttự sắp xếp của các nucleotide trong phân tử DNA. BM-CNSHTVCác mốc giải mã hệ gen của các sinh vật khác nhauCho đến nay, hệ gen của hơn 100 tổ chức sinh vật đã được giải mã trình tự BM-CNSHTVCác phương pháp xác định trình tự Maxam-Gilbert (1977) Sanger (1977) Xác định trình tự tự động  Xác định trình tự thế hệ mới BM-CNSHTV Phương pháp Maxam-Gilbert• Là phương pháp phân giải hóa học• Sử dụng hóa chất để biến đổi DNA ở các vị trí base đặc hiệu tạo ra các đoạn có chiều dài khác nhau Walter Gilbert BM-CNSHTVCác loại hóa chất sử dụng Dimethyl sulfat methyl hóa G. Axit formic pH=2 gây biến đổi và loại A + G. Hydrazin gây biến đổi tại C và T. Hydrazin + NaCl nồng độ cao gây biến đổi tại C. Piperidine được dùng để loại bỏ các base sau khi bị biến đổi và cắt mạch. BM-CNSHTV Chemical used for Chemical used Base Chemical used for altered base for strandspecificity base alteration removal cleavage G Dimethylsulphate Piperidine Piperidine A+G Acid Acid Piperidine C+T Hydrazine Piperidine Piperidine C Hydrazine + alkali Piperidine Piperidine A>C Alkali Piperidine Piperidine BM-CNSHTVJ2 nucleic acid sequencing Maxam and Gilbert chemical method DNA labeled at one end with 32P G C T G C T A Base modification G C T G C T A CH3 Release or displace- ment of reacted bases G C T C T A Strand scission G C T C T A BM-CNSHTVBM-CNSHTVBM-CNSHTV Hạn chế của phương pháp Maxam- Gilbert• Các chất hoá học dùng để cắt mạch đơn không hoàn toàn đặc trưng cho từng phản ứng riêng biệt, phản ứng phụ sẽ diễn ra ảnh hưởng đến kết quả của sản phẩm cắt.• Đây là phương pháp xác định trình tự trực tiếp của DNA, do đó số lượng DNA mẫu cần dùng là rất lớn, nếu lượng mẫu ban đầu ít thì các băng điện di kết quả bằng phóng xạ tự ghi bị mờ, không rõ ràng, khó đọc chính xác.• Phản ứng đòi hỏi DNA mẫu hoàn toàn là mạch đơn, do vậy phải phân tách DNA thành các sợi đơn trước khi tiến hành xác định trỡnh tự.• Chỉ áp dụng xác định trình tự đoạn gen tương đối ngắn, khoảng 250 bp BM-CNSHTV Phương pháp Sanger• Còn gọi là phương pháp kết thúc mạch (chain termination method) hay phuong pháp dideoxyribonucleotide (dideoxyribonucleotide method) BM-CNSHTV Phương pháp Sanger (chain termination or dideoxy method)•Phương pháp enzyme•Nguyên tắc hoạt động: trình tự của một sợi DNA đơnđược xác định dựa vào hoạt động của enzyme DNApolymerase trong quá trình tổng hợp sợi DNA bổ sung.Các sợi DNA được tổng hợp mới này được kết thúc tạicác vị trí đặc hiệu. •DNA polymerase xúc tác gắn các Nu vào mạch đơn đang tổng hợp ở vị trí 3OH, khi gặp nucleotid không có nhóm 3OH, phản ứng tổng hợp bị dừng lại• Nhân tố kết thúc đặc hiệu được sử dụng là cácdideoxynucleotide (phương pháp dideoxynucleotid) BM-CNSHTVCho phép kéo dài mạch ở đầu 3’ Ngăn cản sự kéo dài mạch ở đầu 3’ BM-CNSHTVSự kéo dài mạch DNA BM-CNSHTVSự kéo dài mạch DNA BM-CNSHTVkhi xuất hiện ddNTP Các bước thực hiện1. Chuẩn bị DNA khuôn sợi đơn ...