Bài giảng Công nghệ sinh học đại cương: Chương 2 - ThS. Ninh Thị Thảo (Bài 6)

Bài giảng "Công nghệ sinh học đại cương - Chương 2: Các kỹ thuật nền của CNSH hiện đại (Bài 6)" cung cấp cho người học các kiến thức về kỹ thuật tạo thư viện genome và cDNA bao gồm: Khái niệm thư viện DNA, tạo thư viện mẫu nhân dòng, tạo đoạn DNA có thước phù hợp với nhân dòng,... Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Bài giảng Công nghệ sinh học đại cương: Chương 2 - ThS. Ninh Thị Thảo (Bài 6)CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐẠI CƯƠNG (SH3014) 1 BM CNSH TV – Khoa CNSH CHƯƠNG II: CÁC KỸTHUẬT NỀN CỦA CNSH HIỆN ĐẠI (10 TIẾT) Chức năng và ứng dụng của các enzyme giới hạn Giới thiệu các vector nhân dòng và kỹ thuật nhân dòng gen Các phương pháp lai phân tử Phương pháp PCR, ứng dụng Kỹ thuật xác định trình tự DNA Kỹ thuật tạo thư viện genome và cDNA 8/26/2014 2 BM CNSH TV – Khoa CNSH Khái niệm thư viện DNA•Thư viện DNA, giống như thư viện truyền thống đượcsử dụng để thu thập và lưu trữ thông tin•Trong thư viện DNA thống tin được dự trữ là các phântử DNA Thư viện DNA là tập hợp ngẫu nhiên các đoạn DNA (có tính đại diện đặc thù cho hệ gen của một sinh vật) được chèn vào các vector nhân dòng Có hai loại thư viện mẫu chính đó là:1. Thư viện genome (Genomic library): chứatoàn bộ các đoạn DNA có trong nhân của mộttổ chức hay cơ thể. Genomic library có thểđược nhân dòng bằng plasmid hoặc genomecủa thực khuẩn thể.2. Thư viện cDNA (cDNA library): chứa cácđoạn cDNA có tính đại diện đặc thù cho toànbộ mARN của một mô. Thư viện cDNA đượctạo ra bằng cách tổng hợp nên cDNA từ mRNA. Các bước trong tạo thư viện mẫu đã nhân dòng1. Tạo các đoạn DNA ngẫu nhiên từ hệ gen hay cDNA2. Chèn các đoạn DNA vào vector nhân dòng thích hợp.3. Nhân các đoạn DNA tạo ra trong hệ thống tế bào chủ (chứa vector nhân dòng tương ứng)4. Chọn lọc các dòng có chứa vector mang đoạn DNA mục tiêu.Thiết kế thưviện mẫu chođọc trình tự.• Mỗi một đoạn DNA cài trong một vector biến nạp trong 1 tế bào vi khuẩn  Sách (Book)• Tập hợp tất các các dòng vi khuẩn Thư việnTạo đoạn DNA có kích thước phù hợp cho nhân dòngKích thước của đoạn DNA tùy thuộc vào mục đíchsử dụng thư viện • Để lập bản đồ, xác định các gen hay tách dòng gen từ hệ gen có kích thước lớncần các đoạn DNA lớn và sử dụng các vectơ như phage, cosmid, BAC hay YAC • Để xác định trình tự, lập bản đồ chi tiết… cần các đoạn DNA có kích thước nhỏ, sử dụng vectơ nhân dòng là plasmid • Các đoạn DNA phải có tính ngẫu nhiên để đảm bảo tính đại diện cho hệ gen.Tạo đoạn DNA có kích thước phù hợp cho nhân dòng• Làm gãy nhiễm sắc thể• Cắt bằng RE• Ở genom người dựng RE có vùng nhận biết gồm 8 Nu (NotI, SfiI) sẽ tạo được đoạn cắt có chiều dài lớn• Thông thường dùng RE có vùng nhận biết gồm 4 Nu (AluI, HaeIII)• Cắt không hoàn toàn (partial digest) bằng cách sử dụng phối hợp nhiều REBảng. Khả năng chèn đoạn DNA ngoại lai của một số vector nhândòng Khả năng chứa đoạn Stt Vector DNA(kb) Plasmit Trong một thư viện sẽ chứa bao nhiêu dòng ?• Theo lý thuyết: Số dòng tối thiểu cần thiết để tạo thư viện(n) = độ lớn của hệ gen (b) độ lớn TB của đoạn ADN (a) Ví dụ: thiết kế thư viện hệ gen của người, dùng các vector khác nhau: Kích thước genome : 3 x 109 bp• Plasmid = Take inserts of 0.2 - 20 kb (kb = kilobase = 1000 bases)---> Average insert size of 1000 bases = 3 x 106 clones required to cover one human genome (haploid human)• Lambda Phage = Inserts of 9-23 kb ---> Average insert of 17,000 bases = 1.8 x 105 clones required to cover one human genome• Cosmid = Take inserts of 35-50 kb ---> Average insert of 50,000 bases = 60,000 clones required to cover one human genome• BAC (bacterial artificial chromosome) =Take inserts of ~500 kb ---> Average insert of 500 kb= 6,000 clones required to cover one human genome• YAC (yeast artificial chromosomes) = Take inserts of 200 kb - 1 Mb (Mb = 1 x 106 bases) or greater --> Average insert of 1 Mb = 3,000 clones required to cover one human genomeTrên thực tế, số dòng sẽ lớn hơn bởi quá trình cắt vàghép vào vector là ngẫu nhiên.• Một số dòng sẽ có mặt hơn một lần trong thư viện do hiện tượng lặp đoạn• Một số trình tự nào đó sẽ bị mất nếu chỉ sử dụng số dòng tối thiểu.• Clarke and Carbon (1976) đề nghị công thức tính mới nhằm tính xác suất để một đoạn DNA được nhân dòng trong một thư viện mẫu. N = ln(1-P) ln(1-a/b)• Trong đó: P: xác xuất nhân dòng một đoạn DNA bất kỳ; a: kích thước đoạn DNA cần nhân (bp), b : độ lớn hệ gen (bp) Câu hỏi• Cần bao nhiêu dòng để 99 % một đoạn trình tự có mặt trong thư viện gen của người sử dụng cosmid vector? Học thuyết trung tâm exonDNA Double-stranded ...