Biểu hiện nội bào và khảo sát khả năng tinh chế protein tái tổ hợp trong Bacillus subtilis sử dụng chỉ thị GFP

Bài viết nghiên cứu cho thấy tiềm năng của việc ứng dụng hệ thống vector pHT và chủng chủ an toàn B. subtilis để biểu hiện nội bào và tinh chế protein tái tổ hợp. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết của tài liệu.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Biểu hiện nội bào và khảo sát khả năng tinh chế protein tái tổ hợp trong Bacillus subtilis sử dụng chỉ thị GFPScience & Technology Development, Vol 18, No.T1- 2015Biểu hiện nội bào và khảo sát khảnăng tinh chế protein tái tổ hợp trongBacillus subtilis sử dụng chỉ thị GFP Phan Thị Phượng TrangTrường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM( Bài nhận ngày 26 tháng 12 năm 2014, nhận đăng ngày 03 tháng 08 năm 2015)TÓM TẮTBacillus subtilis và Escherichia coli là haimô hình nghiên cứu đối với vi khuẩn Gramdương và Gram âm, đồng thời cũng là hai hệthống vi khuẩn được sử dụng nhiều tronglĩnh vực công nghệ protein tái tổ hợp. So vớiE. coli, B. subtilis tuy có nhiều ưu điểm hơn,nhất là không lẫn nội độc tố trong sản phẩm,nhưng các nghiên cứu cũng như công nghệnền phục vụ việc biểu hiện và tinh chếprotein tái tổ hợp ở vi khuẩn Gram dươngnày vẫn chưa được quan tâm rộng rãi. Mộtsố nghiên cứu trước đây đã phát triển thànhcông hệ thống vector pHT cho phép biểuhiện protein tái tổ hợp trong B. subtilis mộtcách hiệu quả nhưng vẫn chưa tiến hànhtinh chế và thu nhận protein mục tiêu. Ởnghiên cứu này, chúng tôi tiếp tục sử dụnghệ thống pHT trong B. subtilis để đánh giákhả năng biểu hiện nội bào của protein chỉthị GFP sau khi đã dung hợp với một đuôitinh chế, đồng thời thử nghiệm khả năng tinhchế protein mục tiêu. Vector biểu hiện đượcthiết kế mang gen gfp dung hợp với vùnggen mã hóa đầu N của protein LysS(LysSN), đuôi His-tag và vị trí nhận biết đặchiệu của TEV protease nhằm tăng cườngkhả năng biểu hiện protein mục tiêu cũngnhư giúp tinh chế và cắt bỏ đuôi dung hợp.Kết quả cho thấy vector này cho phép biểuhiện hiệu quả protein dung hợp LysSN6xHis-TEV-GFP trong B. subtilis, proteinmục tiêu có thể được tinh chế thông qua cột2+Ni , đuôi dung hợp có khả năng được cắt bỏhoàn toàn bởi TEV protease. Phân đoạnprotein sau khi tinh sạch được xác định khốilượng phân tử bằng phân tích LC-MS chothấy GFP tái tổ hợp đã được cắt bỏ đuôidung hợp một cách chính xác và được thunhận với độ tinh sạch cao. Nghiên cứu nàycho thấy tiềm năng của việc ứng dụng hệthống vector pHT và chủng chủ an toàn B.subtilis để biểu hiện nội bào và tinh chếprotein tái tổ hợp.Từ khóa: Bacillus subtilis, LysSN, GFP, hệ thống biểu hiện pHT, sắc kí ái lực.GIỚI THIỆUSự bùng nổ trong lĩnh vực nghiên cứu vàphát triển vaccine cũng như protein trị liệu trongnhững năm gần đây đòi hỏi một hệ thống biểuhiện và tinh chế protein tái tổ hợp thật sự hiệuquả, sản phẩm phải có tính an toàn và độ tinhsạch cao. Trong đó, yếu tố quyết định cho việcTrang 52biểu hiện thành công một protein mục tiêu là sựphù hợp giữa đặc tính của protein với vật chủbiểu hiện cũng như quy trình công nghệ kèm theo[2]. Escherichia coli và một số chủng Bacillus lànhững vật chủ prokaryote phổ biến trong côngnghiệp sản xuất protein tái tổ hợp do có ưu điểmTAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 18, SOÁ T1 - 2015tăng trưởng nhanh, mật độ tế bào lớn, môi trườngnuôi cấy rẻ tiền và thao tác nuôi cấy đơn giản.Trong đó, E. coli vẫn được sử dụng thườngxuyên nhất cho đến nay do hệ thống vector đãđược phát triển khá đa dạng, trang thiết bị hỗ trợđầy đủ, các quy trình kĩ thuật đã được tối ưu vớiđộ tin cậy cao và được áp dụng rộng rãi [1]. Tuynhiên, E. coli vẫn tồn tại một số hạn chế về chấtlượng cũng như tính an toàn của sản phẩm. Do làvi khuẩn Gram âm nên màng ngoài của tế bào E.coli chứa nhiều lipopolysaccharide (LPS), haycòn được gọi là nội độc tố, có khả năng gây sốtcao ở người và động vật. Những phân tử nội độctố này cần được loại bỏ hoàn toàn khỏi sản phẩm,do đó quy trình tinh sạch protein mục tiêu trở nênphức tạp và khó khăn [3]. Khác với E. coli,Bacillus subtilis là vi khuẩn Gram dương thuộcnhóm vi khuẩn an toàn GRAS (genrallyrecognized as safe), màng ngoài không chứa LPSnên quy trình tinh sạch sản phẩm đơn giản hơn.Bên cạnh đó, hệ thống vector cho phép biểu hiệnprotein trong B. subtilis cũng đã được phát triểnđầy đủ trong những năm gần đây với nhiều chiếnlược biểu hiện và mức độ biểu hiện khác nhau[4], [5]. Vì vậy, B. subtilis trở thành vật chủ tiềmnăng trong công nghiệp protein tái tổ hợp. Trongnghiên cứu này, chúng tôi sử dụng GFP (Greenfluorescent protein) làm protein chỉ thị để biểuhiện nội bào trong B. subtilis sau khi đã dung hợpvới một đuôi tinh chế chứa His-tag, đồng thờiđánh giá khả năng được tinh chế của protein mụctiêu này thông qua sắc kí ái lực với cột Ni2+.GFP là protein phát huỳnh quang được tìmthấy ở loài sứa biển Aequorea victoria. Proteinnày phát ra ánh sáng màu xanh lục mà mắtthường có thể nhìn thấy sau khi tiếp nhận nguồnánh sáng kích thích có bước sóng ngắn như tiaUV. Đồng thời, hoạt tính phát quang của GFPkhông cần cơ chất cũng như co-factor; việc dunghợp không làm ảnh hưởng đến cấu trúc, chứcnăng và sự định vị của protein mục tiêu; có thểđược biểu hiện trong nhiều vật chủ khác nhau.Điều này khiến GFP trở thành công cụ chỉ thị tốttrong các nghiên c ...