các phương pháp chuyển gen

Nhiều phương pháp khác nhau đã được phát minh để đưa gen vào tế bào và mô động vật và thực vật. Kỹ thuật đơn giản nhất là chuyển DNA trần bằng vi tiêm (microinjection), xung điện (electroporation), súng bắn gen. Các phương pháp phức tạp và hiệu quả hơn bao gồm sử dụng các phức hợp lipid-DNA (liposome), vector virus, tế bào gốc phôi, chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium, chuyển gen bằng súng bắn gen......
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
các phương pháp chuyển gen -ΩΩ*ΩΩ-Các phương pháp chuyển gen 57Chương 2 Các phương pháp chuyển gen Nhiều phương pháp khác nhau đã được phát minh để đưa genvào tế bào và mô động vật và thực vật. Kỹ thuật đơn giản nhất làchuyển DNA trần bằng vi tiêm (microinjection), xung điện(electroporation), súng bắn gen. Các phương pháp phức tạp và hiệuquả hơn bao gồm sử dụng các phức hợp lipid-DNA (liposome),vector virus, tế bào gốc phôi, chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩnAgrobacterium, chuyển gen bằng súng bắn gen... Tuỳ thuộc vào đốitượng chuyển gen mà người ta lựa chọn phương pháp chuyển genphù hợp.I. DEAE-dextran DEAE-dextran là một polycation. Ðây là tác nhân hóa họcđầu tiên được sử dụng để chuyển DNA vào tế bào động vật nuôi cấy. Trong phương pháp này, DNA ngoại lai được cho vào mộttrường nuôi cấy với sự có mặt của DEAE-dextran. DEAE-dextran sẽkết hợp với DNA tích điện âm (Hình 2.1). Sự dư thừa điện tíchdương trong phức hợp DNA-polycation do sự đóng góp củapolycation, cho phép phức hợp này đi đến kết hợp chặt chẽ hơn vớimàng tế bào tích điện âm. Sự xâm nhập của phức hợp có thể đạtđược nhờ sự nhập bào (endocytosis). Hình 2.1: Sự kết hợp giữa DEAE-dextran và DNA 58 Phương pháp này được sử dụng thành công trong việc chuyểnDNA vào các tế bào biểu hiện nhất thời, có nghĩa là thời gian biểuhiện ngắn chỉ vài ngày trong quá trình nghiên cứu. Tuy nhiên,phương pháp này nói chung là không hữu ích đối với các nghiên cứucần sự chuyển nhiễm ổn định dựa vào sự hợp nhất của DNA ngoạilai vào nhiễm sắc thể, hiệu quả biến nạp thấp, chỉ được sử dụng chomột số loại tế bào và cho kết quả tốt đối với tế bào ex vivo. Các polycation khác cũng đã được sử dụng để chuyển DNAvào tế bào như polybrene, polyethyleneimine và dendrimers.II. Kỹ thuật calcium phosphate Kỹ thuật calcium phosphate (calcium phosphate technique) đãđược phát triển đầu tiên là để xác định sự lây nhiễm của DNA virus(Graham,1973) và hiện nay được sử dụng rông rãi để thử nghiệmhoạt động biến nạp của DNA virus cũng như DNA tách chiết từ cáctế bào eukaryote (Wigler, 1978; Graham, 1979; Pellicer, 1980). Kỹ thuật này yêu cầu ủ các tế bào nhận với các chất đồng kếttủa DNA và calcium phosphat (Hình 2.2). Kết tủa này bám vào tếbào và sau đó sẽ hấp thụ vào tế bào qua quá trình ẩm bào (Loyter,1982). Trong tế bào, các phân tử DNA ngoại lai nằm trong khôngbào được tạo thành do ẩm bào và lysosome thứ hai nhưng rất ít DNAđi đến nhân vả hợp nhất vào genome chủ. Hình 2.2: Phức hợp DNA-calcium phosphat 59 Cho đến nay, đây là kỹ thuật vô cùng có giá trị đối với cácnghiên cứu chuyển gen vào các tế bào soma nuôi cấy và đang đượcsử dụng nhiều để chuyển các dòng genome vào tế bào đích. Tỉ lệ cáctế bào được biến nạp ổn định của kỹ thuật này là tương đương vớiphương pháp vi tiêm nhưng khác với vi tiêm là nhiều tế bào đượcbiến nạp cùng một lần. Hơn nữa, biến nạp DNA tách chiết từ các tếbào ung thư vào các tế bào nhận không ung thư đã cho thấy đây làphương pháp duy nhất để nghiên cứu sự kiểm soát di truyền của ungthư. Phương pháp này được sử dụng phổ biến bởi vì đơn giản,protocol dễ thực hiện, ít tốn kém, số tế bào chết sau biến nạp khôngđáng kể, sự biểu hiện gen có thể là nhất thời hoặc ổn định và quantrọng trong việc thiết kế vector virus tái tổ hợp. Tuy nhiên hiệu quảbiến nạp và mức độ biểu hiện của gen chuyển thấp.III. Chuyển gen qua liposome Vào thập niên 1980, liposome nhân tạo đã được sử dụng đểđưa DNA vào tế bào. Lipid với toàn bộ lưới tích điện dương ở pHsinh lý là thành phần lipid tổng hợp phổ biến nhất của liposomeđược phát triển cho chuyển gen (Hình 2.3). Thường thì lipid cationđược trộn với một lipid trung tính như L-dioleoyl phosphatidyl-ethanolamine (DOPE) (Hình 2.4). Phần cation của phân tử lipid kếthợp với DNA tích điện âm và kết quả là chứa đầy DNA trong phứchợp liposome-DNA (Hình 2.5). Ðối với các tế bào nuôi cấy, toàn bộlưới tích điện dương của phức hợp liposome-DNA nói chung là gâyra hiệu quả chuyển gen cao hơn bởi vì nó cho phép phức hợp này kếthợp với màng tế bào tích điện âm bền hơn. Nhờ cơ chế nhập bào,các phức hợp xuất hiện trong endosome và sau đó đi vào nhân (Hình2.6). Chưa rõ DNA được phóng thích từ endosome và đi qua màngnhân như thế nào. DOPE được xem là một lipid kích thích sự dunghợp và vai trò của nó là phóng thích các phức hợp này từ endosomecũng như làm cho sự dung hợp của màng tế bào phía ngoài với phứchợp liposome-DNA xảy ra dễ dàng. Trong phương pháp này, các đạiphân tử trước hết được đưa vào trong các túi phospholipid. Các loạitúi khác nhau đã được mô tả, nhưng túi một lớp mỏng là thích hợpnhất cho chuyển gen vì chúng có tỉ lệ khoảng trống chứa nước ...