Các phương pháp lai phân tử

Phương pháp Southern blot Phương pháp Southern blot được E. Southern phát minh vào năm 1975, cho phép nghiên cứu DNA của bộ gen, kiểm tra kết quả chuyển gen hoặc kiểm tra sự có mặt của một gen nào đó trong bộ gen của tế bào. Để thực hiện được quá trình lai, đầu tiên, người ta phải tách DNA bộ gen của tế bào.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Các phương pháp lai phân tử Các phương pháp lai phân tử1. Phương pháp Southern blotPhương pháp Southern blot được E. Southern phát minh vào năm 1975, chophép nghiên cứu DNA của bộ gen, kiểm tra kết quả chuyển gen hoặc kiểm trasự có mặt của một gen nào đó trong bộ gen của tế bào. Để thực hiện được quátrình lai, đầu tiên, người ta phải tách DNA bộ gen của tế bào. Sử dụngenzyme cắt giới hạn để cắt phân tử DNA thành những đoạn nhỏ, điện di trêngel agarose để tách những đoạn có kích thước khác nhau. Gây biến tính DNAtrên gel bằng dung dịch NaOH-0,5M, sau đó, chuyển DNA từ gel sang mànglai (nitrocellulose). Trong quá trình chuyển, vị trí của DNA phải được giữnguyên.DNA cố định trên màng được lai với mẫu dò có đánh dấu phóng xạ, ở nhiệtđộ 65°C và thời gian lai khoảng 3÷8 giờ. Sau quá trình lai người ta rửa mànglai để loại bỏ những mẫu dò không bắt cặp chuyên biệt với DNA cố định trênmàng lai. Kỹ thuật chuyển DNA từ gel agarose lên màng laiCuối cùng, người ta dùng kĩ thuật phóng xạ tự ghi để định vị các phân tử lai.Trong kĩ thuật này, người ta đặt một phim nhạy cảm với tia xạ áp sát vàomàng lai. Các phân tử lai có đánh dấu phóng xạ sẽ tác động lên phim và kếtquả được thể hiện qua các chấm đen trên phim.Các ứng dụng quan trọng của Sourthern blot: - Lập bản đồ giới hạn của một gen. - Phát hiện các đa dạng trình tự của cùng một gen ở các chủng hay các cá thể khác nhau qua sự so sánh bản đồ giới hạn của chúng. - Phát hiện các đột biến mất đoạn, đột biến điểm hay tái tổ hợp trên một gen vì chúng làm thay đổi bản đồ giới hạn.2. Phương pháp Northern blotPhương pháp lai Northern blot là phương pháp lai RNA của tế bào với mẫudò DNA. Phương pháp này được sử dụng để xác định kích thước và hàmlượng của một mRNA đặc trưng trong một hỗn hợp RNA. Về nguyên tắcgiống như lai Southern blot, được tiến hành như sau:RNA (đã được làm biến tính) sẽ được phân tích theo kích thước nhờ điện ditrên gel agarose có chứa chất làm biến tính. Các chất làm biến tính có tácdụng ngăn cản sự hình thành cấu trúc bậc hai của RNA sau khi đã biến tính.Và do đó, không cản trở sự di chuyển cũng như sự tách của các RNA trêngel. Sau đó, RNA được chuyển lên màng lai. Những RNA cố định trên mànglai được đem lai với mẫu dò DNA có đánh dấu phóng xạ để tạo phân tử laiRNA-DNA. Các phân tử lai được phát hiện nhờ kĩ thuật phóng xạ tự ghi.3. Lai tại chỗLai tại chỗ là phương pháp lai phân tử, trong đó, trình tự axit nucleic cần tìmnằm ngay trong tế bào hay trong mô. Lai tại chỗ cho phép nghiên cứu axitnucleic mà không cần qua giai đoạn tách chiết chúng ra khỏi mô, tế bào. Cácứng dụng của kiểu lai này rất đa dạng đi từ kĩ thuật định vị gen trên nhiễmsắc thể, phát hiện dòng vi khuẩn tái tổ hợp trong phương pháp tạo dòng đếnviệc nghiên cứu một mRNA chuyên biệt trong tế bào và mô. Phương phápnày ít tốn kém hơn là lai Southern blot, mẫu dò được đánh dấu bằng huỳnhquang thay cho mẫu dò đánh dấu phóng xạ. Tùy từng loại tế bào và mô có thểthực hiện các phương pháp lai tại chỗ khác nhau.Lai trên khuẩn lạcPhương pháp này được sử dụng để phát hiện dòng vi khuẩn có mang vectortái tổ hợp cần tìm trong một ngân hàng gen. Ngân hàng gen được trải trênmặt thạch của hộp petri. Sau khi các khuẩn lạc đạt kích thước nhất định,người ta thu lấy dấu ấn của chúng bằng cách áp một màng lai trên mặt thạch.Mỗi khuẩn lạc sẽ để lại vài tế bào vi khuẩn trên màng lai. Sau đó xử lí mànglai bằng NaOH để làm vỡ tế bào vi khuẩn và làm biến tính DNA. Kết quảphóng xạ tự ghi của dấu ấn cho phép xác định dòng vi khuẩn cần tìm trên hộppectri ban đầu. Dòng này sẽ được thu nhận và phân tích.Lai trên nhiễm sắc thểPhương pháp này cung cấp thông tin chính xác về vị trí và sự phân bố củamột trình tự DNA cần tìm trên nhiễm sắc thể nhờ một mẫu dò chuyên biệt.Chọn tế bào kì giũa của quá trình phân bào khi các nhiễm sắc thể có kíchthước lớn nhất (các nhiễm sắc thể này thường có nguồn gốc từ bạch cầu).Bằng các kĩ thuật xử lí cố định tế bào trên lam kính, định vị hình dạng và vịtrí của nhiễm sắc thể. Sử dụng enzyme RNase và enzyme protease K để loạibỏ RNA và protein. Nhiễm sắc thể cố định trên lam được đem lai với mẫu dòDNA hoặc RNA có đánh dấu phóng xạ. Sử dụng kĩ thuật phóng xạ tự ghi đểphát hiện phân tử lai (phân tử lai trên lam được phủ một huyền dịch nhạycảm với tia xạ). Sau một thời gian, cho tia xạ tác động lên huyền dịch, lamđược đem quan sát dưới kính hiển vi. Tại các điểm có các phân tử lai xuấthiện các chấm đen trên lớp huyền dịch.Lai trên tế bào và môLai trên tế bào và mô thường được sử dụng để phát hiện các mRNA. Các loạimRNA hoạt động ở các giai đoạn khác nhau tron ...