Các phương pháp tách dòng gen Tách dòng gen

Tách dòng gen (gene cloning), còn được gọi với nhiều tên khác nhau: tạo dòng gen, nhân dòng gen, phân lập gen…Tách dòng gen là tập hợp các kỹ thuật nhằm đưa một gen, một đoạn DNA cần thiết (DNA ensert) vào tế bào chủ (host cell), tạo điều kiện tích hợp để các tế bào chủ phân chia, tạo nên vô số các tế bào cùng mang một đoạn DNA insert giống nhau, tạo nên một dòng tế bào tái tổ hợp mang gen cần tách dòng....
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Các phương pháp tách dòng gen Tách dòng gen III. Các phương pháp tách dòng gen Tách dòng gen (gene cloning), còn ư c g i v i nhi u tên khác nhau: t o dònggen, nhân dòng gen, phân l p gen…Tách dòng gen là t p h p các k thu t nh m ưam t gen, m t o n DNA c n thi t (DNA ensert) vào t bào ch (host cell), t o i uki n tích h p các t bào ch phân chia, t o nên vô s các t bào cùng mang m t o n DNA insert gi ng nhau, t o nên m t dòng t bào tái t h p mang gen c n táchdòng. Tách dòng gen có t h ư c th c hi n theo nhi u phương pháp khác nhau.Cácphương pháp tách dòng gen ch y u u c s d ng nhi u trong công ngh sinh h cphân t là tách dòng th c nghi m (cloning in vitro) và tách dòng o (cloning insilico). 1. Tách dòng invitro. Tách dòng in vitro hay tách dòng th c nghi m là tách dòng gen ư c th c hi nt các m u sinh h c (mô t vào, lông tóc, d ch sinh h c…), mang các gen c n táchdòng ho c t ng h p nhân t o o n gen c n tách dòng. Tách dòng in vitro g m phương pháp khác nhau, có th tách dòng t DNA, tách RNA ho c tách dòng trên cơ sdòng t trình t cac acid amin trong chu ipolypeptid…. 1.1. Tách dòng gen t DNA: Tách dòn t DNA g m các bư c cơ b n sau: Bư c 1: Chuân b gen c n tách dòng (gen c n thi t, gen ích - target gene) vàch n vectơ tách dòng. - Chu n b gen c n tách dòng: Trong các phòng thí nghi m sinh h c ph n t gen c n tách dòng thư ng ư ctách chi t t các m u sinh h c. Phương pháp này chu n b gen tách dòng b ng t ngh p nhân t o t các oligonucleotid ít ư c s d ng, do k thu t ph c t p, t n kém và chu n xác không cao. Trư ng h p chưa bi t trình t c a gen c n tách dòng, ph i d a vào kích thư c ch n l c o n gen c n tách dòng. Các bư c th c hi n chc a gen c n tách dòngy u: tách chi t DNA b gen, nhân gen b ng PCR, s d ng enzym gi i h n c t thànhcác o n DNA nh , i n di trên gel agar (ho c gel polyacrylamid) v i thang DNA 1 i n di, d a vào kích thư c c a gen c n tách dòng l a ch n ư cchu n. T k t qu o n DNA ch a gen c n tách dòng. Sơ k thu t tách dòng th c nghi m - Ch n vectơ tách dòng D a vào kích thư c gen c n tách dòng và m c ích tách dòng ch n vectơtách dòng là plasmid, phage, các nhi m s c th nhân t o… Bư c 2: T o vectơ tái t h p. S d ng các enzym gi i h n thích h p c t các gen c n tách dòng và vectơ táchdòng nh ng v trí c hi u gi ng nhau, t o i u ki n thu n l i cho quá trình tái th p gi a vectơ tách dòng và các o n DNA inset. S d ng enzym n i DNA ligase g ncác gen c n tách dòng vào vectơ có hi u qu , hình thành các vectơ tái t h p(recombinant vectơ). hi u qu t o vectơ tái t h p cao, c n chú ý t l thích h p gi a vectơ táchdòng và các o n DNA insert, ng th i b sung các enzym n i DNA thích h p.Enzym T4DNA ligase xúc tác hình thành các liên k t phosphoeste n i các do n DNA 2 u b ng v i nhau, nên ư c s d ng r t r ng rãi trong t o vectơ n i các o nctDNA. Bư c 3: Bi n n p vectơ tái t h p vào t bào ch . Bi n n p vectơ tái t h p vào t bào ch (host cell) b ng các phương pháp khácnhau: Siêu âm, vi tiêm, b n gen, s d ng PEG (polyethylen glycol)… V i các t bàoch là vi khu n thư ng s d ng phương pháp bi n n p s c nhi t. Phương pháp s cnhi t có hi u qu cao v i các t bào ch là vi khu n E.coli và m t s loài vi khu nkhác. Trư ng h p t bào ch là n m men có th s d ng phương pháp bi n n p làxung i n, bán gen…. Bư c 4: Sàng l c các dòng tái t h p Sàng long (screeing) các th tái t h p nh m ch n l c các t bào mang vectơ táit h p trong qu n th . Tuỳ thu c gen ch th (marker) trong các vectơ tái t h p là ch l a ch n phương pháp thích h p.th kháng sinh, ho c ch th màu Bư c 5: Nuôi c y dòng tái t h p thu sinh kh i và protein tái t h p. Nuôi c y các dòng tái t h p trong môi trư ng dinh dư ng các i u ki n thích t 108 - 109 t bào/1ml có th li tâm thu sinh kh i t bào.h p, khi m t t bào 1.2. Tách dòng gen t RNA thông tin (mRNA). Tách dòng gen t mRNA là m t quá trình ph c t p, có th th c hi n theo cácbư c sau: Bư c 1: Tách chi t mRNA RNA thông tin ư c tách chi t theo các protcol thông d ng trong các phòng thínghi m. Có th s d ng s c kí ái l c v i bi t có mang oligo nucleotid T. Các phân tmRNA có uôi poly A t o liên k t v i oligo - dT, làm cho các phân t mRNA bámtrên b m t các viên bi t . S d ng k thu t li tâm phân o n tách mRNA ra kh i bi t - 850C thu mRNA. Có th gi mRNA nhi t ti p t c nghiên c u. Bư c 2: T ng ...