Chọn dòng và biểu hiện gen keratinase trong Escherichia coli bl21(de3) từ vi khuẩn Bacillus

Bài viết tập trung vào việc nâng cao năng suất và hoạt tính keratinase thông qua nhân bản gen và biểu hiện keratinase tái tổ hợp. Vì vậy, chúng tôi tiến hành nhân đoạn gen mã hóa keratinase bằng phản ứng PCR từ 2 chủng vi khuẩn B. licheniformis và B. subtilis, chọn dòng trong hệ vector pET và biểu hiện trong vi khuẩn E. coli.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Chọn dòng và biểu hiện gen keratinase trong Escherichia coli bl21(de3) từ vi khuẩn BacillusTẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 51-57CHỌN DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN KERATINASETRONG ESCHERICHIA COLI BL21(DE3) TỪ VI KHUẨN BACILLUSNguyễn Thu Hiền1, Hoàng Thị Thu Hiền1, Khuất Hữu Thanh2, Nguyễn Huy Hoàng1*1Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam, *nhhoang@igr.ac.vn2Trường Đại học Bách khoa Hà NộiTÓM TẮT: Bacillus licheniformis và Bacillus subtilis là hai chủng vi khuẩn có khả năng thủy phân lôngvũ cao. Protein keratinase từ hai chủng này đã được nghiên cứu khá phổ biến, đây là nhóm enzyme thươngmại, có nhiều ứng dụng quan trọng trong các ngành công nghiệp, trong các quá trình công nghệ sinh họcliên quan đến chất thải có chứa keratin từ ngành công nghiệp gia cầm và công nghệ da. Mặt khác, keratinsau khi bị thủy phân có thể làm thức ăn chăn nuôi, phân bón, keo, tạo ra được các axit amin hiếm nhưserine, cystein và proline và góp phần giảm thiểu ô nhiễm môi trường. Nhằm mục đích thu được lượngenzyme có hoạt tính cao, chúng tôi tiến hành biểu hiện gen keratinase tái tổ hợp từ B. licheniformis vàB. subtilis trong Escherichia coli. Gen Ker 1 từ chủng B. licheniformis HT10 được tích hợp vào vectorpET22b và gen Ker 2 từ B. subtilis Đ.nđ1.2 được tích hợp vào vector pET32a. Trong cùng điều kiện biểuhiện ở 37oC, cảm ứng IPTG nồng độ 1mM, hai protein thu được có kích thước và hoạt độ enzyme khácnhau lần lượt là 28 kDa, 23,5 U/ml và 36 kDa, 18,5 U/ml.Từ khóa: Bacillus lichenniformis, Bacillus subtilis, E. coli, biểu hiện gen, keratinase.MỞ ĐẦUKeratin là thành phần chủ yếu trong lôngvũ, là protein cấu trúc sợi, giàu liên kếtdisulfide, hydro và các đầu tương tác kị nướcdẫn đến độ bền cơ học cao. Theo Lin et al.(2009) [6], keratin không hòa tan trong nước vàkhông phân hủy bởi các enzyme phân giảiprotein phổ biến như trypsin, pepsin và papain.Nhưng keratin có thể bị phân hủy bởi các visinh vật có khả năng sinh keratinase cao.Hiện nay, keratinase được thu từ nhiềunguồn khác nhau như nấm, xạ khuẩn, vi khuẩn.Trong nhóm vi khuẩn có khả năng sinhkeratinase, hoạt tính keratinase cao đã được ghinhận rộng rãi đối với các chủng từ Bacillus.Keratinase có đặc tính sinh hóa rất đa dạng khiđược thu từ các nguồn khác nhau. Mặc dù chỉphân lập trong phạm vi hai chủng vi khuẩn B.licheniformis và B. subtilis nhưng cũng cho tathấy sự đa dạng của keratinase. Đối với B.licheniformis, theo nghiên cứu của Lin et al.(1992) [7], keratinase có khối lượng phân tử 33kDa, pH tối ưu đã được xác định 7.5, nhiệt độtối ưu là 50°C và ổn định khi bảo quản ở -20°C.Đối với chủng B. subtilis, keratinase có khốilượng phân tử là 25,4 kDa, pH tối ưu là 7,5 vànhiệt độ tối ưu là 70°C theo công bố của Gupta& Ramnani (2006) [2]. Nhiều nghiên cứu ghinhận rằng keratinase được phân lập từ chủngB. licheniformis và B. subtilis, là thành viên củanhóm protease serine, điều này đã được đề cậpđến trong công bố của Brandelli (2008) [1]. Đâylà nhóm enzyme thương mại, có nhiều ứng dụngquan trọng trong các ngành công nghiệp, trongcác quá trình công nghệ sinh học liên quan đếnchất thải có chứa keratin từ ngành công nghiệpgia cầm và công nghệ da. Mặt khác keratin saukhi bị thủy phân có thể làm thức ăn chăn nuôi,phân bón, keo, tạo ra các axit amin hiếm nhưserine, cystein và proline, làm giảm ô nhiễmmôi trường [9].Do tầm quan trọng của keratinase trong cácngành công nghiệp, keratinase đã được nghiêncứu khá nhiều. Nhưng để đáp ứng nhu cầu ngàycàng tăng của keratinase trong ứng dụng côngnghiệp, những nghiên cứu tập trung vào việcnâng cao năng suất và hoạt tính keratinasethông qua nhân bản gen và biểu hiện keratinasetái tổ hợp. Vì vậy, chúng tôi tiến hành nhânđoạn gen mã hóa keratinase bằng phản ứng PCRtừ 2 chủng vi khuẩn B. licheniformis và B.subtilis, chọn dòng trong hệ vector pET và biểuhiện trong vi khuẩn E. coli.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨUVật liệu51Nguyen Thu Hien, Hoang Thi Thu Hien, Khuat Huu Thanh, Nguyen Huy HoangB. licheniformis HT10, B. subtilis Đnđ1.2(mã số FN692035.1) đã được phân lập từ vùngđất chăn nuôi và giết mổ gia cầm tại Hà Nội đãđược công bố bởi Nguyễn Huy Hoàng và nnk.(2010) [4].Phương phápChọn dòng gen keratinaseKhuếch đại đoạn gen KerTrình tự mồi đặc hiệu để khuếch đại đoạngen Ker được thiết kế bằng cách phân tích độtương đồng nucleotide từ đoạn gen keratinasecủa chủng B. subtillis và B. licheniformis đãđược đăng kí trên Gen Bank (bảng 1). Theophương pháp của Nguyễn Thị Minh và nnk.(2011) [8], đoạn mồi được gắn thêm trình tự cácenzyme giới hạn để khuếch đại được đoạn genKer từ điểm khởi đầu đến điểm kết thúc.Bảng 1. Trình tự các cặp mồiChủngMồiB. licheniformis ker-F1HT10 - GenKer1ker-R1B. subtilisĐnđ1.2 - GenKer2ker-F2ker-R2Trình tự mồi (chiều 5’ đến 3’)5’-TCCATGGATGATGAGGAAAAAGAGTTTTGGC-3’Nco I5’-TGGATCCTTATTGAGCGGCAGCTTCG-3’BamHI5’-CGTGGGATCCAAAAAATTGTGGATCAGC-3’BamHI5’-TTATTCTCGAGCTGCTTGTACGT ...