CNSHDV: Nuôi cấy tế bào Động vật

• Có 2 kiểu TB: - TB phụ thuộc vào chỗ neo để bám dính: Bám vào đáy bình nuôi cấy và tạo thành lớp đơn bao phủ toàn bộ bề mặt vật thể nuôi cấy (confluence) - TB không phụ thuộc vào chỗ neo (là những TB kết hợp với dịch lỏng trong cơ thể, ví dụ: TB máu)
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
CNSHDV: Nuôi cấy tế bào Động vậtChương 4. Nuôi cấy tế bào động vật Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật• Dụng cụ nuôi cấy:- Bình flask đơn giản- Máy lên men phức tạp có màn hình điều khiển • Điều kiện nuôi cấy:• Môi trường nuôi cấy: - Khí oxy- Glucose - Khí CO2- Nước- Amino acid- Các muối• Huyết thanh ĐV: Thường dùng là FBS- Cần thiết cho sự phát triển của TB ĐV- Bổ sung 5 - 10% vào môi trường nuôi cấy TB• Chất chỉ thị dùng bổ sung vào môi trường nuôi cấy TB ĐV: phenol red- Các chất thải từ TB làm thay đổi pH môi trường- Môi trường thay đổi từ đỏ sang vàng• Kiểm soát nhiệt độ và pH:- 37.0 OC- pH 7.5• Phương pháp đo sự phát triển của TB ĐV:- Đếm TB bằng buồng đếm hồng cầu- Đo mật độ quang bằng máy quang phổ• Khử trùng bằng:- Bổ sung kháng sinh vào môi trường nuôi cấy- Lọc vô trùng- Hấp khử trùng dụng cụ• Có 2 kiểu TB:- TB phụ thuộc vào chỗ neo để bám dính: Bám vào đáy bình nuôi cấy và tạo thành lớp đơn bao phủ toàn bộ bề mặt vật thể nuôi cấy (confluence)- TB không phụ thuộc vào chỗ neo (là những TB kết hợp với dịch lỏng trong cơ thể, ví dụ: TB máu)• Confluence tối ưu để chuyển TB sang đĩa mới là 70-80%• Có 2 dạng TB ĐV được nuôi cấy:- TB nuôi cấy sơ cấp: tách ra từ mô mới, vòng đời nuôi cấy bị giới hạn, được xử lý bằng trypsin để tách thành những TB đơn như TB biểu bì, nguyên bào sợi- Dòng TB liên tục: được biến nạp làm mất đi tính nhạy đối với các nhân tố kiểm soát sự phát triển, tạo ra những dòng TB bất tử, được tạo hình lại; dễ nuôi cấy hơn TB sơ cấp Các điều kiện nuôi cấy TB ĐV• Số thế hệ TB: số lần TB được tách chuyển (“split”) từ đĩa và nuôi cấy sang đĩa khác• Đệm phosphate không có Ca2+ Mg2+ (PBS) được dùng để rửa và loại bỏ huyết thanh trong môi trường tránh ức chế chức năng của Trypsin- EDTA.- Calcium cũng ức chế chức năng của Trypsin-EDTA.- Phải làm ấm trước khi sử dụng để TB không bị sốc bởi dung dịch lạnh• Enzym dùng để tách TB khỏi đĩa nuôi cấy là trypsin:- Trypsin cắt nối peptid (LYS hoặc ARG) trong fibronectin của chất nền ngoại bào.- EDTA nối với ion calcium trong môi trường- Trypsin sẽ tự phân hủy và mất hoạt tính nếu trong bể nước hơn 20 phút.- Trypsin hóa TB quá lâu sẽ làm giảm khả năng sống của TB• Chất tẩy: dùng để loại bỏ TB còn lại trong đĩa hoặc ống nuôi cấy• Bể nước: dùng để làm ấm môi trường, PBS, ...