Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn in vitro của quy trình sản xuất cao khô lá Neem (xoan chịu hạn) (Azadirachta indica A.Juss Meliaceae)

Lá Neem (xoan chịu hạn) Azadirachta indica A.Juss Meliaceae được chiết siêu âm với các dung môi có độ cồn khác nhau, lọc, cô dịch chiết đến cao đặc, tiến hành đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao đặc bằng phương pháp khuếch tán qua giếng thạch (well diffusion agar). Từ kết quả hiệu suất chiết và hoạt tính kháng khuẩn, xây dựng quy trình sản xuất cao khô lá xoan thu mua tại Ninh Thuận với dung môi cồn 25% có hoạt tính kháng khuẩn với vi khuẩn gram dương Staphylococcus aureus (MIC=80 mg/ml).
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn in vitro của quy trình sản xuất cao khô lá Neem (xoan chịu hạn) (Azadirachta indica A.Juss Meliaceae) ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN IN VITRO CỦA QUY TRÌNH SẢN XUẤT CAO KHÔ LÁ NEEM (XOAN CHỊU HẠN) (AZADIRACHTA INDICA A.JUSS MELIACEAE) Phạm Vi Minh Ngọc, Nguyễn Trọng Nhân, Phan Thị Anh Thư Khoa Dược, Trường Đại học Công nghệ TP. Hồ Chí Minh GVHD: ThS.DS. Thái Hồng Đăng, ThS. Dương Minh Trí TÓM TẮT Lá Neem (xoan chịu hạn) Azadirachta indica A.Juss Meliaceae được chiết siêu âm với các dung môi có độ cồn khác nhau, lọc, cô dịch chiết đến cao đặc, tiến hành đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao đặc bằng phương pháp khuếch tán qua giếng thạch (well diffusion agar). Từ kết quả hiệu suất chiết và hoạt tính kháng khuẩn, xây dựng quy trình sản xuất cao khô lá xoan thu mua tại Ninh Thuận với dung môi cồn 25% có hoạt tính kháng khuẩn với vi khuẩn gram dương Staphylococcus aureus (MIC=80 mg/ml). Từ đó cho thấy tác dụng kháng khuẩn của lá Neem phụ thuộc vào dung môi chiết, nguồn nguyên liệu và vẫn duy trì hoạt tính trong suốt quá trình sản xuất chế phẩm cao khô. Từ khóa: azadirachta indica, hiệu suất chiết xuất, hoạt tính kháng khuẩn, lá xoan chịu hạn, Neem 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Cây Neem Azadirachta indica A.Juss., họ Xoan Meliaceae là loài thực vật thường xanh phân bố châu Á, châu Phi và các vùng có khí hậu nhiệt đới; thường được gọi là Xoan chịu hạn, Xoan Ấn Độ, Neem,…[11] nhưng Neem là tên thường được sử dụng nhiều nhất. Thành phần hóa học chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học bao gồm alkaloid, flavonoid, triterpenoid, phenol, carotenoid, steroid và ceton; về mặt sinh học thì hợp chất có hoạt tính mạnh nhất là azadirachtin. Dược liệu này có tác dụng như: chống dị ứng, chống nhiễm trùng, kháng virus, kháng nấm, chống viêm, hạ sốt, tẩy giun, lợi tiểu, diệt côn trùng, diệt ấu trùng, diệt tinh trùng và các tác dụng sinh học khác [7], [9], [11], [12]. Các hoạt chất trong Neem tác động đến rất nhiều loài dịch hại theo các phương thức: gây ngán ăn xua đ ổi, làm chết côn trùng qua đường tiếp xúc và đường miệng, ức chế sự sinh trư ng và gây đột biến, ảnh hư ng đến khả năng giao phối, ảnh hư ng khả năng đẻ trứng và làm thối trứng động vật [1]. Trên thế giới, nhiều nghiên cứu về hoạt tính kháng khuẩn của cây Neem nói chung và lá Neem nói riêng khá đã được công bố, tập trung vào dịch chiết từ các dung môi chiết xuất như hexane, methanol, chloroform, ethyl acetate, petroleum ether [8],[10], [13]. Ở Việt Nam, các nghiên cứu về các dạng bào chế từ lá Neem chưa nhiều, tập trung vào các hợp chất phân lập từ trong cây Neem [1], [6] và một vài nghiên cứu khảo sát về hoạt tính kháng khuẩn của cao đặc chiết với dung môi như cồn 96% hay nước [4], [5]. Cao khô lá Neem sản xuất tại Trung tâm nghiên cứu và sản xuất dược liệu miền Trung (TTNCSXDLMT) được sử dụng trong ngành nuôi trồng thủy hải sản tại Phú Yên nhằm mục đích phòng và điều trị các 639 vi sinh vật gây bệnh cho thủy hải sản với vai trò là kháng sinh sinh học. Tuy nhiên trong thực tế sử dụng đã ghi nhận sự khác nhau về tác dụng kháng khuẩn của cao khô lá Neem từ nguyên liệu mẫu lá thu mua và nguồn cây trồng. Chính vì thế, đề tài “Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn in vitro của quy trình sản xuất cao khô lá Neem (xoan chịu hạn) (Azadirachta indica A.Juss Meliaceae)” đã được thực hiện nhằm đánh giá sự ảnh hư ng của nguồn nguyên liệu, dung môi chiết xuất và quy trình sản xuất đến hoạt tính kháng khuẩn của cao khô lá Neem. Từ đó xây dựng quy trình sản xuất cao khô lá Neem quy mô phòng thí nghiệm và duy trì hoạt tính kháng khuẩn trong suốt quy trình. Đề tài sẽ cung cấp cơ s khoa học cho trung tâm để ứng dụng sản xuất sản phẩm mới trong tương lai. 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng Mẫu lá Neem (6 tháng tuổi) thu hái tại TTNCSXDLMT- Đ ng Hòa, Phú Yên vào tháng 12/2020, lô 010321 (hình 1) và mẫu lá được thu mua tại Ninh Thuận, lô 020920, ngày 07/09/2020 (hình 2). Bảo quản: nhiệt độ 20-25 oC trong túi kín khí. Môi trường: Nutrient Agar (NA), Nutrient Broth (NB), NaCl 0,9%. Chủng vi sinh vật thử nghiệm: Staphylococcus aureus và Escherichia coli cung cấp b i khoa Sinh học – Trường đại học Khoa học tự nhiên TPHCM. Mặt trước Mặt sau Mặt trước Mặt sau Hình 1. Lá thu hái tại TTNCSXDLMT Hình 2. Lá thu mua tại Ninh Thuận 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Chuẩn bị mẫu Lá được sấy khô nhiệt độ 60 oC và xay đến kích thước 1-3 mm. 2.2.2 Đánh giá ảnh hưởng dung môi chiết xuất đến hoạt tính kháng khuẩn - Dung môi chiết xuất được nghiên cứu là dung môi thường sử dụng trong sản xuất công nghiệp để dễ dàng nâng cấp cỡ lô. - Chiết riêng lẻ mỗi 30g nguyên liệu với 150 ml ethanol 96%, 70%, 50%, 25% và nước, siêu âm 30 phút, lặp lại 2 lần với 100 ml dung môi và lọc qua bông [14]. 640 - Hiệu suất chiết xuất của các dung môi được tính theo công thức sau: trong đó: M1: khối lượng bột lá nguyên liệu (g); M2: khối lượng cao (g). A1: độ ẩm bột lá nguyên liệu (%); A2: độ ẩm cao (%). - Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn được thực hiện bằng phương pháp khuếch tán qua giếng thạch (well diffusion agar) [5] như sau:  Chuẩn bị dịch kháng khuẩn: • Đối chứng âm: dung dịch DMSO 5% vô trùng. • Đối chứng dương: kháng sinh Ciprofloxacin (1 mg/ml pha trong DMSO 5%) [14]. • Cao lá Neem được pha trong dung dịch DMSO 5% vô trùng thành các nồng độ sau: 800 mg/ml, 400 mg/ml, 200 mg/ml, 100 mg/ml.  Số liệu thống kê được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 2010 và Statgraphics centurion xv version 15.1.02. Sự khác biệt có ý nghĩa được xác định mức tin cậy ≥ 99%. - Nguyên liệu và dung môi chiết xuất trong quy trình sản xuất cao khô được lựa chọn dựa trên hiệu suất chiết và hoạt tính kháng khuẩn. 2.2.3 Đánh giá hoạt ...