Đề tài: Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR – RFLP xác định kiểu gene của vi rút viêm gan B

Mục tiêu đề tài: "Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR – RFLP xác định kiểu gene của vi rút viêm gan B" nhằm hoàn thiện qui trình kỹ thuật PCR – RFLP xác định kiểu gene của HBV và bước đầu xác định sự phân bố các kiểu gene của HBV ở nhóm bệnh nhân nghiên cứu.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Đề tài: Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR – RFLP xác định kiểu gene của vi rút viêm gan B ĐỀ TÀI ”Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR – RFLP xác định kiểu gene của vi rút viêm gan B” ĐẶT VẤN ĐỀ Viêm gan virút B (VGVR B) hiện nay vẫn là một bệnh rất phổ biến trên toàn thế giới và luôn là một mối quan tâm lớn đối với công tác y tế của toàn cầu và cũng như của Việt Nam. Bệnh có tỷ lệ mắc cao và thường gây nên những hậu quả nặng nề như viêm gan mạn, xơ gan và ung thư tế bào gan nguyên phát. Trên thế giới, có hơn hai tỉ người bị nhiễm vi rút viêm gan B (HBV), trong đó có khoảng 350 - 400 triệu người bị nhiễm HBV mạn tính. Khoảng 25 đến 40% số người bị nhiễm HBV mạn tính này tử vong sớm vì những biến chứng là xơ gan và/hoặc ung thư gan. (Lee và CS 1997) Việt Nam nằm trong vùng dịch tễ cao của vi rút viêm gan B, ước tính có khoảng 10 triệu người mang HBsAg nên viêm gan vi rút B là vấn đề quan trọng của sức khoẻ cộng đồng. Tỷ lệ mang HBsAg cao nhất là lứa tuổi từ 41-50 chiếm 18,7% trong khi lứa tuổi có tỷ lệ thấp nhất từ 0-10 là 10,7 %. Nhưng tỷ lệ HBeAg(+) /HBsAg(+) của lứa tuổi 0 - 10 là 91 %. Theo diễn biến tự nhiên, tỷ lệ mất HBsAg hàng năm là 1-2%, và chuyển đổi huyết thanh HBeAg chung là 9,6%. Vào những năm cuối thế kỷ 20, kỹ thuật sinh học phân tử ra đời và có tốc độ phát triển nhanh chóng đã mở ra một kỷ nguyên mới về chẩn đoán gen nên chúng ta đã có thể chẩn đoán được vi rút viêm gan B ở mức độ phân tử. Nhờ ứng dụng các kỹ thuật về phân tích DNA của HBV mà chúng ta có thể giải quyết được các hạn chế của các kỹ thuật miễn dịch kinh điển. Các kỹ thuật sinh học phân tử này bao gồm các xét nghiệm HBV – DNA : kỹ thuật PCR, Realtime – PCR (PCR với thời gian thực) và bDNA (khuyếch đại tín hiệu), xác định các kiểu gene của HBV và xác định các đột biến kháng thuốc. Cho đến nay, 2 vấn đề mới nổi lên và đang được quan tâm trong việc chẩn đoán HBV là vai trò thực sự của kiểu gen vi rút viêm gan B và sự đột biến của vi rút B trong quá trình diễn tiến tự nhiên của bệnh cũng như dưới tác động của thuốc đặc trị. Để xác định kiểu gene của HBV hiện nay có nhiều phương pháp. Đó là: + Phương pháp giải trình tự gene (Sequencing) + Phương pháp lai trên pha rắn như Test INNO – LIPA. + Phương pháp realtime – PCR technique. + Phương pháp PCR đa mồi. + Phương pháp PCR – RFLP. Tuy nhiên mỗi phương pháp có những ưu nhược điểm riêng. Phương pháp giải trình tự gene, lai trên pha rắn, kỹ thuật Realtime – PCR và PCR đa mồi có ưu điểm xác định các kiểu gene của HBV một cách chính xác do sự thiết kế các cặp mồi đặc hiệu. Nhưng có nhược điểm là công tác chuẩn bị mẫu mất nhiều thời gian và bên cạnh đó cần phải có những trang thiết bị hiện đại do đó giá thành cho một xét nghiệm còn cao. Phương pháp PCR – RFLP là sử dụng các enzyme giới hạn TasI và SspI cắt các trình tự đã biết của sản phẩm PCR nhân đoạn gene của HBV. Qua đó xác định kiểu gen của HBV thông qua phân tích tính đa hình của các đoạn giới hạn. Đây là một phương pháp đơn giản dễ thực hiện không cần những trang thiết bị đắt tiền do đó đáp ứng được yêu cầu về mặt giá thành và cũng rút ngắn được thời gian. Chính vì những lý do đó chúng tôi tiến hành đề tài ” Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR – RFLP xác định kiểu gene của vi rút viêm gan B” với các mục tiêu: 1. Hoàn thiện qui trình kỹ thuật PCR – RFLP xác định kiểu gene của HBV. 2. Bước đầu xác định sự phân bố các kiểu gene của HBV ở nhóm bệnh nhân nghiên cứu. TỔNG QUAN 1. TÌNH HÌNH NHIỄM VI RÚT VIÊM GAN B 1.1. Tình hình nhiễm HBV trên thế giới. Trên thế giới, có hơn hai tỉ người bị nhiễm HBV, với ước lượng 350-400 triệu người bị nhiễm HBV mạn tính. Khoảng 25 đến 40% số người bị nhiễm HBV mạn tính này chết sớm vì xơ gan và/hoặc ung thư gan. Ba phần tư số người mang HBV sống ở châu Á; tỷ lệ người mang HBV mạn tính ở Trung Quốc và Ðông Nam Á ở mức cao từ 8% dân số trở lên. Nhiễm HBV cũng phổ biến ở châu Phi hạ Sahara. Tỉ lệ lưu hành HBV ở mức trung bình tại vùng Ðịa Trung Hải, Nhật Bản, và một phần Ðông Âu. Nhiễm HBV tương đối ít gặp, ảnh hưởng dưới 2% dân số, tại phần lớn Tây Âu, châu Úc và châu Mỹ. Mặc dù vậy, hàng năm có khoảng 300.000 người tại Hoa Kỳ và có đến một triệu người châu Âu bị nhiễm bệnh. Sự khác biệt về tỉ lệ lưu hành toàn cầu là do khác biệt về các đường lây truyền HBV chính. Ở các vùng bệnh lưu hành địa phương như châu Á và Tây Phi, lây truyền HBV thường xảy ra trong thời kỳ chu sinh, với tỉ lệ lây truyền cho trẻ sơ sinh cao đến 90% từ các bà mẹ có HBsAg và HBeAg dương tính. Cách lây truyền này cũng xảy ra ở những vùng có tỉ lệ lưu hành thấp, chủ yếu là ở những người nhập cư từ các vùng có bệnh lưu hành địa phương. Hơn nữa, nhiễm bệnh ở tuổi càng nhỏ, thì cơ hội trở thành người mang HBV mạn tính càng cao. Các chương trình tiêm chủng tuy thành công, nhưng vẫn thường gặp các trường hợp mới nhiễm HBV tại nhiều nước có mức độ lưu hành địa phương cao, và có hàng triệu người đã nhiễm siêu vi mà đối với họ những văc-xin hiện dùng không có tác dụng. Do đó, can thiệp điều trị là phương án duy nhất đối với những người có bệnh gan thật sự do nhiễm HBV. 1.2. Tình hình nhiễm HBV ở Việt Nam. Tại Việt Nam , rất nhiều công trình nghiên cứu đã chỉ ra rằng tỷ lệ nhiễm HBV ở nước ta cho thấy Việt Nam nằm ở vùng dịch lưu hành cao. Tại Hà Nội, theo Hoàng Thuỷ Nguyên và cs, Trần Thị Chính và cs, Phan Thị Phi Phi và cs, tần suất nhiễm HbsAg của người lớn bình thường lần lượt là 15 – 26%, 14,4% và 13,9. Tại thành phố Hồ Chí Minh, theo Trần Văn Bé và Bửu Mật, thì tỷ lệ này là 9,3. Ở qui mô nghiên cứu cộng đồng, đã có 2 công trình khảo sát tỷ lệ mang HbsAg bằng các biện pháp nghiên cứu dịch tễ học. Công trình của Lê Vũ Anh được tiến hành năm 1988 tại cộng đồng dân cư Hà Nội bằng phương phá ...