Định vị miễn dịch hiển vi điện tử các kháng nguyên trong tế bào

Miễn dịch hiển vi điện tử là phươngpháp kết hợp kỹ thuật miễn dịch với kỹthuật hiển vi điện tử để định vị các thμnhphần miễn dịch đặc hiệu, các đại phân tửsinh vật.Phương pháp định vị hiển vi điện tử cácthμnh phần miễn dịch trong tế bμo có thểtiến hμnh theo nhiều phương pháp khácnhau. Trước tiên tế bμo cần cắt mỏng tạinhiệt độ thấp (không đúc) hoặc tại nhiệt độphòng (có đúc). Việc đánh dấu miễn dịchcó thể thực hiện trực tiếp hoặc gián tiếptrước khi đúc, sau khi đúc hoặc trên lát cắtlạnh ...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Định vị miễn dịch hiển vi điện tử các kháng nguyên trong tế bàoTCNCYH 26 (6) - 2003 §Þnh vÞ miÔn dÞch hiÓn vi ®iÖn tö c¸c kh¸ng nguyªn trong tÕ bµo NguyÔn Kim Giao ViÖn VÖ sinh dÞch tÔ trung −¬ng Sù kÕt hîp c¸c kü thuËt miÔn dÞch víi kü thuËt hiÓn vi ®iÖn tö ®· ®−îc sö dông tõ l©utrong sinh häc tÕ bµo (TB). HiÖn nay ph−¬ng ph¸p miÔn dÞch hiÓn vi ®iÖn tö (MDHV§T)®−îc ¸p dông réng r·i ®Æc biÖt lµ nghiªn cøu chÈn ®o¸n vi sinh vËt. Trong nghiªn cøu nµy, chóng t«i ®· sö dông kü thuËt ®¸nh dÊu miÔn dÞch b»ng vµnggi¸n tiÕp sau khi ®óc víi tÕ bµo Vero nu«i cÊy nhiÔm vi rót sëi vµ tÕ bµo TVP nu«i cÊynhiÔm vi rót rota SA11. Theo dâi c¸c h¹t ®en trªn ¶nh, chóng t«i ®· ®Þnh vÞ ®−îc c¸c vi rótrota trong tÕ bµo TVP vµ nhËn biÕt ®−îc qu¸ tr×nh h×nh thµnh cña vi rót sëi trong TB Vero.I. §Æt vÊn ®Ò Môc tiªu nghiªn cøu cña ®Ò tµi nh»m: MiÔn dÞch hiÓn vi ®iÖn tö lµ ph−¬ng 1. Lùa chän vµ x¸c ®Þnh ®−îc nh÷ngph¸p kÕt hîp kü thuËt miÔn dÞch víi kü ®iÒu kiÖn, nh÷ng th«ng sè tèt nhÊt lµm tiªuthuËt hiÓn vi ®iÖn tö ®Ó ®Þnh vÞ c¸c thµnh b¶n miÔn dÞch hiÓn vi ®iÖn tö ph¸t hiÖnphÇn miÔn dÞch ®Æc hiÖu, c¸c ®¹i ph©n tö kh¸ng nguyªn mÆt ngoµi tÕ bµo phï hîpsinh vËt. víi ®iÒu kiÖn ViÖt Nam. Ph−¬ng ph¸p ®Þnh vÞ hiÓn vi ®iÖn tö c¸c 2. Nghiªn cøu x¸c ®Þnh sù tån t¹i cñathµnh phÇn miÔn dÞch trong tÕ bµo cã thÓ vi rót rota trªn tÕ bµo TVP vµ sù nh©n lªntiÕn hµnh theo nhiÒu ph−¬ng ph¸p kh¸c cña vi rót sëi trªn tÕ bµo Vero trong qu¸nhau. Tr−íc tiªn tÕ bµo cÇn c¾t máng t¹i tr×nh nu«i cÊynhiÖt ®é thÊp (kh«ng ®óc) hoÆc t¹i nhiÖt ®é II. VËt liÖu, mÉu, thiÕt bÞ vµ quiphßng (cã ®óc). ViÖc ®¸nh dÊu miÔn dÞch tr×nh kü thuËt nghiªn cøucã thÓ thùc hiÖn trùc tiÕp hoÆc gi¸n tiÕp 1. Nguyªn lý chungtr−íc khi ®óc, sau khi ®óc hoÆc trªn l¸t c¾tl¹nh [1, 3]. chÊt ®óc WF l¸t c¾t tÕ bµo tiªu b¶n chÊt cè ®Þnh (4,5% PFA 0,1% GA) l−íi ®óc c¾t l¸t máng cè ®Þnh Khö n−íc tÝm l−íi l−íi Quan s¸t HV§TTQ parafilm röa ®¸nh dÊu miÔn dÞch Nhuém d−¬ng b¶n6TCNCYH 26 (6) - 2003 H×nh 1: Qui tr×nh lµm tiªu b¶n ®Þnh vÞ kh¸ng nguyªn trong tÕ bµo sau ®óc mÉu Nh÷ng tÕ bµo hoÆc m« ®−îc cè ®Þnh vµ ®óc trong nh÷ng khu«n ®óc b»ng nh÷ng chÊt ®Æc biÖt ®Ó gi÷ cÊu tróc vµ b¶o toµn chøc n¨ng miÔn dÞch. Nh÷ng mÉu ®óc ®−îc c¾t thµnh nh÷ng l¸t cùc máng vµ ®Æt lªn trªn c¸c l−íi nicken. TiÕp ®ã nh÷ng l¸t c¾t ®−- îc béc lé tíi c¶ kh¸ng thÓ thø nhÊt, kh¸ng thÓ thø hai råi ®−îc röa vµ nhuém tr−íc khi kiÓm tra ë kÝnh hiÓn vi ®iÖn tö truyÒn qua t¹i ®é phãng ®¹i cao. Kü thuËt c¾t cùc máng kh«ng nh÷ng cho phÐp ®Þnh vÞ nh÷ng kh¸ng nguyªn ë phÝa trong mÉu mµ cßn tiÕp cËn ®−îc tíi nh÷ng protein, nh÷ng kh¸ng nguyªn vµ nh÷ng ®¹i ph©n tö kh¸c trªn bÒ mÆt cña l¸t c¾t v× chóng sÏ bÞ béc lé trong qu¸ tr×nh c¾t. H×nh 1 lµ s¬ ®å chung lµm tiªu b¶n ®Ó ®Þnh vÞ kh¸ng nguyªn trong tÕ bµo sau ®óc mÉu . H×nh 2 lµ s¬ ®å ®¸nh dÊu miÔn dÞch hiÓn vi ®iÖn tö trªn l¸t c¾t máng. §iÒu cÇn chó ý ë ®©y lµ kh¸ng kh¸ng thÓ hoÆc kh¸ng thÓ thø hai ®−îc thay b»ng ProteinA-Au. H×nh 2: S¬ ®å ®Þnh vÞ kh¸ng nguyªn trªn l¸t c¾t b»ng ®¸nh dÊu miÔn dÞch g¾n vµng gi¸n tiÕp 2. VËt liÖu 4.1. M¸y c¾t tiªu b¶n siªu máng: - Ho¸ chÊt: paraformaldehyde, Ultramicrotome III (LKB, Thuþ §iÓn).glutaraldehyde, OsO4, ®Öm PBS, BSA, 4.2. KÝnh hiÓn vi ®iÖn tö truyÒn qua:ethanol, uranyl acetate, lead citrate . JEM 1010 (JEOL, Japan) víi c¸c th«ng - L−íi nicken, giÊy ¶nh ®en tr¾ng sè:Sterlin. phim FUJI-FG + §iÖn ¸p gia tèc ®iÖn tö 30-100KV, 3. MÉu nghiªn cøu ...