Giải trình tự ADN

Phương pháp chính xác và đưa lại nhiều thông tin nhất cho định danh và định typ vi sinh vật là xác định chính xác trình tự chuỗi ADN của một vùng quy định trên nhiễm sắc thể. Phương pháp giải trình tự ADN phát triển nhanh chóng, kết quả so sánh sự tương đồng của trình tự gene nghiên cứu trở thành phương pháp phân loại chuẩn theo sinh học phân tử trong nghiên cứu hệ thống học và cây phả hệ di truyền giữa các đối tượng nghiên cứu. Các gene bảo thủ được giải trình tự...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Giải trình tự ADN Giải trình tự ADN Phương pháp chính xác và đưa lại nhiều thông tin nhất cho định danh vàđịnh typ vi sinh vật là xác định chính xác trình tự chuỗi ADN của một vùng quyđịnh trên nhiễm sắc thể. Phương pháp giải trình tự ADN phát triển nhanh chóng,kết quả so sánh sự tương đồng của trình tự gene nghiên cứu trở thành phươngpháp phân loại chuẩn theo sinh học phân tử trong nghiên cứu hệ thống học và câyphả hệ di truyền giữa các đối tượng nghiên cứu. Các gene bảo thủ đ ược giải trìnhtự làm cơ sở để xác định vị trí của sinh vật nghiên cứu, trong khi đó các trình tựkhông tương đồng (khác biệt) lại làm cơ sở cho sự biệt hóa cũng như xác định mốiquan hệ giữa các cá thể gần với nhau. + Nguyên tắc: Phương pháp giải trình tự ADN theo nguyên tắc tạo ra các mảnh ADNđược đánh dấu tại đầu 5’ hoặc 3’. Các mảnh có các base đánh đấu đ ược tách ratrên gel polyacrylamid Các mảnh được phân biệt về vị trí trên gel với sự sai khácchỉ với một nucleotid. Việc đánh dấu và đọc kết quả theo các kỹ thuật và phươngpháp khác nhau. Việc tạo ra các mảnh ADN sai khác nhau về 1 nucleotid đượctrình bày theo 2 ph ương pháp: phương pháp hóa học (Maxam & Gilbert, 1997) vàphương pháp enzym kết thúc phản ứng chuỗi (Sanger, 1997). Ngày nay phươngpháp enzym được dùng phổ biến hơn cả. + Phương pháp enzym kết thúc phản ứng chuỗi của Sanger: Phương pháp kết thúc phản ứng chuỗi được thực hiện dựa trên việc nhânADN từ sợi khuôn khi có đoạn ADN mồi với xúc tác của Klenow hay T7-ADNpolymerase và 4 loại deoxyribonucleotid (dNTPs). Như vậy, có 4 phản ứng đượctiến hành đồng thời và trong mỗi phản ứng thì có một loại dNTP bị thay đổi bởimột dẫn xuất để làm dừng phản ứng (ddNTP). Kết quả là phản ứng chuỗi bị dừngđặc hiệu cho mỗi một base xác định xảy ra một cách ngẫu nhi ên trong mỗi phảnứng. Trình tự của ADN được xác định trên gel. Đầu tiên phương pháp này đượcxây dựng cho xác định trình tự sợi ADN đơn tạo ra bằng cách tách dòng ADN vàovectơ thực khuẩn thể M13 (Sanger và cộng sự, 1978). Sau đó phương pháp xácđịnh trình tự sợi đôi ADN đã được Chen, William (1986) mô tả khi tách dòngADN vào plasmid. Ngày nay người ta lựa chọn phương pháp Sanger để giải trìnhtự ADN cho nghiên cứu phân loại và xác định typ vi sinh vật thay cho ph ươngpháp hóa học. Một số lợi thế của phương pháp này ở chỗ: Phương pháp này đơn giản vàkhông tốn nhiều thời gian như phương pháp hóa học. Khi nghiên cứu phân loại vàxác định typ thì các gene nghiên cứu có độ bảo thủ nhất định vì vậy ta có thể dùngchung mồi cho nhiều đối tượng khác nhau. Một trong hạn chế của phương phápnày ở chỗ các đoạn ADN cần được tách dòng trước khi tiến hành giải trình tựADN. Tuy nhiên cho đến nay người ta đã cải tiến phương pháp này để có thể giảitrình tự trực tiếp sản phẩm PCR. + Giới thiệu kỹ thuật giải trình tự ADN theo Sanger: Có hai phương pháp: Phương pháp giải trình tự truyền thống đọc kết quảtrên bản gel (đánh dấu bằng phóng xạ l à chủ yếu) và phương pháp giải trình tự vàđọc kết quả tự động (đánh dấu bằng hóa chất huỳnh quang). Phương pháp truyền thống: - Các bước chính cho giải trình tự ADN như sau: Chuẩn bị ADN khuôn Bắt cặp ADN khuôn và mồi Tiến hành phản ứng giải trình tự ADN Tách sản phẩm trên gel polyacrylamid bi ến tính với urea. Đọc kết quả. Tuy nhiên cần chú ý một số điểm sau: Chuẩn bị ADN khuôn. 1. Điều kiện bắt cặp mồi. 2. Thực hiện phản ứng giải trình tự ADN. 3. Tách sản phẩm trên acrylamid gel. 4. Đọc kết quả. 5. Một số điểm cần được chi tiết thêm cho mỗi bước như sau: 1, Chuẩn bị ADN khuôn: Sợi khuôn cần được hiểu là việc giải trình tự được thực hiện với sợi đơn(vectơ M13) hay sợi đôi ADN. Việc đọc trình tự theo sợi đơn thường cho kết quảlà kích thước đoạn gene đọc dài và độ chính xác cao. Ngày nay người ta thườngđọc sợi đôi vì việc chuẩn bị mẫu dễ dàng hơn, ngoài ra khi sử dụng hai phản ứngvới hai mồi tương thích thì quá trình đọc lại chính xác hơn. Đó là ưu thế của cáchđọc sợi đôi ADN. Do vậy, rất cần đọc kết quả từ cả hai sợi ADN. Hiện nayphương pháp đọc trình tự ADN trực tiếp từ sản phẩm PCR đang ngày càng trở lênphổ biến. 2, Chuẩn bị sợi ADN mồi cho bước bắt cặp vào sợi khuôn: Người ta có thể dùng các đoạn ADN mồi tiêu chuẩn đặc hiệu cho trình tựADN của vectơ gần sát với sợi khuôn hay primer đặc hiệu của sợi khuôn mà nó sẽbắt cặp vào. Tiện ích của việc dùng mồi chuẩn ở chỗ mọi điều kiện đã được lựachọn cho sợi khuôn và mồi được dùng lặp đi lặp lại nhiều lần cho các sợi khuônkhác nhau. Hạn chế của loại mồi này ở chỗ chỉ đọc được một đoạn ngắn của gene(300 – 50 ...