Giáo trình CN nuôi cấy mô tế bào thực vật - Chương 4

4.4. Các giai đoạn trong quy trình nhân giống vô tính in vitro4.4.1. Quá trình sản xuất cây cấy mô Quá trình vi nhân giống thông thường gồm năm giai đoạn chính, mỗi một giai đoạn có những yêu cầu riêng. Giai đoạn 1: Chuẩn bị cây làm vật liệu gốc - Chọn cây mẹ để lấy mẫu, thường là cây ưu việt, khỏe, có giá trị kinh tế cao. - Chọn cơ quan để lấy mẫu thường là chồi non, đoạn thân có chồi ngủ, hoa non, lá non v.v… - Mô chọn để nuôi cấy thường là các...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Giáo trình CN nuôi cấy mô tế bào thực vật - Chương 4 142 Sơ đồ 4.3. Mẫu mô phát sinh callus, callus phát sinh phôi soma (hoặc nuôi cấy dịch huyền phù tế bào phát sinh phôi soma) và từ phôi thu được cây hoàn chỉnh4.4. Các giai đoạn trong quy trình nhân giống vô tính in vitro 4.4.1. Quá trình sản xuất cây cấy mô Quá trình vi nhân giống thông thường gồm năm giai đoạn chính, mỗi một giaiđoạn có những yêu cầu riêng.Giai đoạn 1: Chuẩn bị cây làm vật liệu gốc - Chọn cây mẹ để lấy mẫu, thường là cây ưu việt, khỏe, có giá trị kinh tế cao. - Chọn cơ quan để lấy mẫu thường là chồi non, đoạn thân có chồi ngủ, hoa non, lánon v.v… - Mô chọn để nuôi cấy thường là các mô có khả năng tái sinh cao, sạch bệnh, giữđược các đặc tính sinh học quý của cây mẹ và ổn định. Tùy điều kiện, giai đoạn này cóthể kéo dài 3 - 6 tháng.Giai đoạn 2: Thiết lập hệ thống nuôi cấy vô trùngGiáo trình nuôi cấy mô tế bào thực vật 143 - Khử trùng bề mặt mẫu vật và chuẩn bị môi trường nuôi cấy. - Cấy mẫu vô trùng vào môi trường nhân tạo trong ống nghiệm hoặc bình nuôi.Giai đoạn nuôi cấy này gọi là cấy mẫu in vitro. - Các mẫu nuôi cấy nếu không bị nhiễm khuẩn, nấm hoặc virus sẽ được lưu giữtrong phòng với điều kiện nhiệt độ, ánh sáng phù hợp. Sau một thời gian nhất định, từmẫu nuôi cấy bắt đầu xuất hiện các cụm tế bào hoặc cơ quan (chồi, cụm chồi, rễ) hoặcphôi vô tính có đặc tính gần như phôi hữu tính. Giai đoạn 2 thường yêu cầu 2 - 12 thánghoặc ít nhất 4 lần cấy chuyển.Đưa mẫu vật từ bên ngoài vào nuôi cấy vô trùng phải đảm bảo những yêu cầu sau: - Tỷ lệ nhiễm thấp. - Tỷ lệ sống cao. - Tốc độ sinh trưởng nhanh. Kết quả bước cấy gây này phụ thuộc rất nhiều vào cách lấy mẫu. Quan trọng nhấtvẫn là đỉnh sinh truởng, chồi nách, sau đó là đoạn hoa tự, hoa, đoạn thân, mảnh lá, rễ… Chọn đúng phương pháp khử trùng sẽ đưa lại tỷ lệ sống cao và môi trường dinhdưỡng thích hợp sẽ đạt được tốc độ sinh trưởng nhanh.Giai đoạn 3: Nhân nhanh chồi- Thành phần và điều kiện môi trường phải được tối ưu hóa nhằm đạt mục đích nhânnhanh.- Quy trình cấy chuyển để nhân nhanh chồi khoảng 1- 2 tháng tùy loại cây. Hệ số nhânnhanh là 2 - 8 lần/ 1 lần cấy chuyển. Nhìn chung giai đoạn 3 thường yêu cầu 10- 36 thángvà cũng không nên kéo dài quá lâu. Ví dụ từ đỉnh sinh trưởng của 1 cây chuối chọn lọcban đầu, người ta chỉ nên nhân khoảng 2000 - 3000 chồi sau 7 - 8 lần cấy chuyển để tránhbiến dị sôma. Đối với các cây khác như mía, hoa cúc, phong lan sau 1 năm có thể nhânđược trên 1 triệu chồi từ 1 cây mẹ ban đầu.Những khả năng tạo cây đó là: - Phát triển chồi nách. - Tạo phôi vô tính. - Tạo đỉnh sinh trưởng mới. Trong giai đoạn này cần nghiên cứu các tác nhân kích thích phân hóa cơ quan,đặc biệt là chồi như: - Bổ sung tổ hợp phytohormone mới (tăng cytokinin giảm auxin). Tăng tỷ lệauxin/cytokinin sẽ kích thích mô nuôi cấy tạo rễ và ngược lại sẽ kích thích phát sinh chồi.Giáo trình nuôi cấy mô tế bào thực vật 144 - Tăng cường thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày, tối thiểu 1.000 lux. Trong thực tếnghiên cứu, người ta nhận thấy khó tách biệt ảnh hưởng của chu kỳ chiếu sáng khỏi ảnhhưởng của cường độ chiếu sáng. Ánh sáng tím là thành phần quan trọng kích thích phânhóa mạnh. Ánh sáng đỏ có ảnh hưởng giống cytokinin (cytokinin-like effect), nó tạo nênsự tích lũy cytokinin trong mô của một số loài, chính lượng cytokinin này đã góp phầnkích thích quá trình phát sinh cơ quan và tạo chồi từ những mô nuôi cấy in vitro. - Bảo đảm chế độ nhiệt độ trong khoảng 20-30oC. Trường hợp những loài cónguồn gốc nhiệt đới, nhiệt độ nuôi cấy thích hợp vào khoảng từ 32-35oC. Ngược lại, đốivới những loài hoa ở vùng ôn đới nhiệt độ thích hợp cho quá trình tạo cụm chồi phải <30oC. Mục tiêu quan trọng nhất của giai đoạn này là xác định được phương thức nhânnhanh nhất bằng môi trường dinh dưỡng và điều kiện khí hậu tối thích.Giai đoạn 4: Tạo rễ - Các chồi hình thành trong quá trình nuôi cấy có thể phát sinh rễ tự nhiên, nhưngthông thường các chồi này cần phải cấy chuyển sang một môi trường khác để kích thíchtạo rễ. ở một số loài khác, các chồi sẽ tạo rễ khi được chuyển trực tiếp ra đất. Giai đoạn 4thông thường cần 2 - 8 tuần.Giai đoạn 5: Chuyển cây ra đất trồng - Đây là giai đoạn đầu tiên, trong đó cây được chuyển từ điều kiện vô trùng củaphòng thí nghiệm ra ngoài tự nhiên. Đối với một số loài có thể chuyển chồi chưa có rễ rađất, nhưng đa số chỉ sau khi chồi đã ra rễ và tạo cây hoàn chỉnh mới được chuyển ra vườnươm. Quá trình thích nghi với điều kiện bên ngoài của cây cần sự chăm sóc đặc biệt. Vìcây chuyển từ môi trường bão hòa hơi nước sang vườn ươm với những điều kiện khókhăn hơn, nên vườn ươm cần phải đáp ...