Giáo trình Cơ sở di truyền chọn giống thực vật: Phần 2

Phần 2 giáo trình trình bày các nội dung: Lai tế bào soma, kỹ thuật chuyển gen và ứng dụng của nó trong chọn giống thực vật, kỹ thuật RFLP trong nghiên cứu di truyền và chọn giống thực vật, kỹ thuật PCR và ứng dụng của nó trong chọn giống thực vật.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Giáo trình Cơ sở di truyền chọn giống thực vật: Phần 298 Chương 5 LAI TỂ BÀO SOMA5.1. M ỏ ĐẦU N hư ta đă biết, khác với các tế bào động vật, tế bào thực vật ctí thành tế bào là lớpbao ngoài cùng. Thành tế bào gồm xenlulo (khoảng 20-30 % ), hemixenluỉo và pectin. Nếunhư thành tế bào bị tách bỏ, thì lúc đđ tế bào thực vật sẽ lộ ra lớp m àng sinh chất ngoàicùng, m à trạng thái ta gọi là tế bào tràn hay protoplast. Khi các protoplast tiếp xúc vớinhau thỉ chúng cổ thể hợp nhất lại làm một, m à ta gọi là 8ự dung hợp protoplast. Nếunhư các protoplast cđ nguòn gốc từ các tế bào soma thuộc các giống, loài hoặc chi khácnhau được dung hợp lại thi nó cđ thể dẫn đến hiện tượng lai té bào soma (somatichybrydization), Vi tế bào thực vật cố thành tế bào, nên trước đây trong một thời gian dài người tacho ràng kỷ th u ật dung hợp protoplâst chỉ giới hạn ở các tế bào động vật; mặc dầu ngaytừ rấ t sớm Kuster (1909) đă nêu ra ý tưởng sử dụng phương pháp lai tế bào soma đểvượt qua những khó khản nảy sinh trong quá trình lai xa ở thực vật. Mãi cho đến nảm1960, sau những nghiên cứu thành cổng của Cocking với việc dùng m ột hỗn hợp cáce m y m cellulose, pectinase và maceroz 3nne để tách bỏ thành tế bào thực vật, thi kỹ th u ậtdung hợp protoplast mdi được áp dụng ở thực vật. Tuy nhiên, nổ chi thực sự phát triểnm ạnh m ế và cố xu hiỉớng được úng dụng trong chọn giổng chỉ sau các kết quả n ^ i ê ncứu về việc tái sinh hoàn chỉnh cây thuổc lá từ protopỉast của Ikkebe (1971) và việc táisinh cây thuốc lá lai do dung hợp protoplast giữa hai loài N. tabacum với N. langsdorfficủa Carlson (1972), Sự ra đời của kỹ th u ật protoplast cho phép ngườỉ ta tẹo ra những tái tổ hợp di truyềngiữa các đơn vị phân loại xa ( loài hay chi) m à bằng phương pháp ỉai hữu tính khò hoặckhông đ ạ t được. Trong quá trỉnh dung hợp, bên cạnh sự kết hợp giữa các genom trongnhân, còn cố th ể xảy ra sự hợp n h ất tế bào chất giữa các protoplast. Nhờ vậy, một sốtính trạ n g do các gen trong tế bào chất kiểm soát, như tính bất thụ đực, cố thể đượcchuyển m ột cách không khó khăn từ cây này sang cây khác nhờ kỹ th u ật này. Muốn tiến hành lai tế bào soma càn phải tách được các protoplast m ột cách nguyênvẹn, cho chúng dung hợp với nhau, làm cho các sản phẩm dung hợp phân chia và tái sinhchúng th àn h cây.5.2. TÁCH PROTOPLAST Về nguyên tác, có hai phương pháp tách bỏ thành tế bào thực vật : phương pháp cơhọc và phương pháp dùng enzyin. Txy nhiên, trong thực tế người ta chỉ dùng phươngc o s ỏ DI TRUYỀN CHỌN GIỐNG THỤC VẬT 99pháp enzym, vì nđ cd^hiệu suẩt rấ t cao mà lại không gây thương tổn cho tế bào. Khi thành tế bào được tách ra, protoplast phải được phóng thích ra môi trường cdáp suất thắm tháu cao để trán h nước xâm nhập vào không bào, gây vỡ protoplast ( vídụ, cd th ể dùng dung dịch manitol 0,5 M). Tuy nhiên, thời gian lưu lại ở đó không nênquá dài khiến cho trao đổi chất của tế bào và cấu trúc màng lưới sinh chất bị tổn hại. Dể tách protoplast, ví dụ từ cây thuốc lá được trồng trong nhà kính, được tướithường xuyên ở 25C, thỉ lá thứ ba từ trên xuống là ngiiồn thực liệu thích hợp nhất. Láđược khử trùng bằng ethanol 70% trong vài giây, sau đó được nhúng vào dung dịchhypoclorit canxi 5% rồi rửa bằng nước cất. Lá được thái nhỏ cho vào đỉa P etri chứa hỗnhợp enzym như sau : 0,1 % cellulase, 0,02% macerozyme và 0,05% driselase, để qua đêm(khoảng 16 h). Sau đó lọc qua rây cđ lỗ 50 - 80 /ym, rồi rửa 2 làn bàng dung dịch mớikhông chứa enzyxn bầng cách ly tâm. Ngoài lá, người ta cd th ể dùng phần trụ dưới lá mầm hay rễ làm nguyên liệu táchprotoplast. Do không chứa diệp lục nên nguồn protoplast này dễ phân biệt với cácprotoplast được tách ra từ mô th ịt lá. Một nguồn nguyên liệu khác cũng được dùng đểtách protoplast là các tế bào nuôi cấy dạng huyền phù. Đôi với các cây hoà thảo, điều cầnbiết là, chỉ cd các protoplast được tách ra từ các tế bào phôi được nuôi cấy dạng huyềnphù mới có khả nảng phân chia và tái sinh cao (Fujimura,1985 ).53. DUNG HỘP PROTOPLAST Lần đầu tiên Carlson (1972) đã tái sinh ra những cây thuốc lá từ protoplast bàngcách cho dung hợp protoplast trong môi trường cfòng thẩm tích của dung dịch n itratnatri. Còn Melchers (1974 ) thì dung hợp protoplast củng của thuốc lá ở môi trường 50mM Ca + 0,4 M manitol với pH = 10,5. Môi trường của Melchers tỏ ra rá t thích hợpcho việc dung hợp tế bào chất. Sau này, Kao (1974) đả phát hiện ra chát polyethylenglycol (PEG) cd tác dụng làm tân g hiệu quà dung hợp của protoplast; vl nd là chất qd áilực với nước, làm tăng tính thẩm thấu và tăng bề m ặt tiếp xúc giữa các protoplast. Chỉsau vài phút được ngăĩh vào dung dịch 20 - 40 % (w/v) của PBG (mol. Wt. 1500 - 1600)hàu như tấ t cà các protoplast đều được kết dính lại. Tuy nhiên, việc dung hợp chỉ thựcsự xảy ra khi ...