Giáo trình CÔNG NGHỆ DNA TÁI TỔ HỢP - Chương 7

Chương 7gen tái tổ hợp trong Escherichia coliV Escherichia coli E. coli hoặc tăng hiệu s . Mặc dù E. coli không phải là một vật chủ lý tưởng để biểu hiện các gen của eukaryote do chúng không có khả năng sửa đổi hậu dịch mã (post-translation modification) cho các chuỗi polypeptide của các protein có cấu trúc phức tạp. Tuy nhiên, trong một số trường hợp người ta vẫn có thể sử dụng vi khuẩn E. coli cho những protein có cấu trúc đơn giản hơn. Đối với những protein có cấu trúc phức tạp, vật chủ thường...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Giáo trình CÔNG NGHỆ DNA TÁI TỔ HỢP - Chương 7Chương 7 gen tái tổ hợp trong Escherichia coli V Escherichia coli E. coli hoặc tăng hiệu . Mặc dù E. coli không phải là mộtsvật chủ lý tưởng để biểu hiện các gen của eukaryote do chúng không có khảnăng sửa đổi hậu dịch mã (post-translation modification) cho các chuỗipolypeptide của các protein có cấu trúc phức tạp. Tuy nhiên, trong một sốtrường hợp người ta vẫn có thể sử dụng vi khuẩn E. coli cho những proteincó cấu trúc đơn giản hơn. Đối với những protein có cấu trúc phức tạp, vậtchủ thường được sử dụng là các cơ thể eukaryote (ví dụ: nấm menSaccharomyces cerevisiae, nấm mốc Aspergillus niger…) do chúng có thểhậu dịch mã được. Để biểu hiện tất cả các gen ngoại lai trong E. coli phải bắt đầu bằngviệc gắn đoạn gen ngoại lai vào trong vector biểu hiện (thường là plasmid).Vector này phải có đủ các cấu trúc cần thiết sau: ạo ra nhiều bản sao trong -T (ori)tế bào vật chủ. - Các trình tự mã hóa gen chỉ thị chọn lọc (selectable marker) để đảmbảo duy trì vector trong tế bào. - Một promoter kiểm soát phiên mã (ví dụ: lac, trp hoặc tac) cho phépsản xuất một lượng lớn mRNA từ các gen được tạo dòng. - Các trình tự kiểm soát dịch mã như trình tự liên kết ribosome đượcbố trí thích hợp và codon khởi đầu AUG. - Một polylinker để đưa gen ngoại lai vào trong một hướng chính xácvới promoter. Chỉ khi được cấu trúc đầy đủ như thế, các vector biểu hiện mang genngoại lai mới được biến nạp vào chủng E. coli thích hợp. 155Công nghệ DNA tái tổ hợp Chương này mô tả các phương pháp và các plasmid vector được sửdụng để sản xuất các protein dung hợp (fusion protein) và các proteinnguyên thể (native protein) trong vi khuẩn. Các protein dung hợp có thểđược sản xuất với một lượng lớn, dễ dàng tinh sạch và có thể được dùng đểgây ra một đáp ứng miễn dịch. Các protein nguyên thể có thể được sản xuấttrong vi khuẩn bằng cách gắn một promoter mạnh và một trình tự liên kếtribosome hiệu quả ngược hướng với gen được tạo dòng (vùng 5’ không dịchmã). Thông thường, các protein được biểu hiện ở mức độ cao trong các thểvùi không hòa tan.I. Sản xuất các protein dung hợp1. Protein dung hợp Protein dung hợp (protein lai) được mã hóa bởi một gen lai do sự dunghợp in vitro hai đoạn gen khác nhau. Vì vậy, protein dung hợp sẽ mang trìnhtự amino acid của hai protein khác biệt (Hình 7.1). Gen dung hợp Promoter ATG Gen B Gen A DNA SD ATG mRNA SD Met Protein dung hợp N CHình 7.1. Protein dung hợp. Bao gồm gen được tạo dòng (gen A) và một genkhác của vi khuẩn (gen B), do đó protein dung hợp có chứa một phần protein củavi khuẩn. SD: đoạn Shine-Dalgarno. Sự dung hợp gen được thực hiện bằng cách gắn phần mã hóa của genđược tạo dòng ở gần đầu cuối 3’ của gen vi khuẩn (ví dụ: gen lacZ). Proteindung hợp có những ưu điểm sau: 156Công nghệ DNA tái tổ hợp - Protein dung hợp thường được sản xuất với hàm lượng lớn do sựkhởi đầu phiên mã và dịch mã được điều khiển bởi các trình tự tiêu chuẩncủa E. coli. - Dung hợp các trình tự ngoại lai với các gen của E. coli thường chokết quả các sản phẩm ổn định hơn các protein ngoại lai nguyên thể. - Protein dung hợp có khối lượng phân tử lớn hơn so với hầu hết cácprotein của E. coli và vì thế dễ dàng nhận biết trong điện di polyacrylamidegel của protein. Băng protein dung hợp có thể được cắt ra khỏi gel, đông khô(lyophilize) sau đó nghiền thành bột và dùng như một kháng nguyên. - .T .2. Các hệ thống vector biểu hiện các gen dung hợp với gen lacZ Một số hệ thống vector được phát triển để biểu hiện các gen dung hợpvới gen lacZ. Chẳng hạn, các vector họ pUR có các vị trí tạo dòng BamHI,SalI, PstI, XbaI, HindIII và ClaI ở đầu 3’ của gen lacZ (Hình 7.2). Bằngcách chọn lựa các vector và vị trí cắt hạn chế thích hợp người ta có thể tiếnhành dung hợp cho hầu hết gen được tạo dòng. Trong một số trường hợp, sựdung hợp có thể thực hiện bằng cách loại bỏ đầu tận cùng lồi hoặc làm đầyđầu tận cùng bị khuyết trước khi gắn. Một hệ thống vector tương tự khác cũng được phát triển để sản xuấtcác protein dung hợp, đó là các vector biểu hiện pEX1-3. Promoter PR đượcđiều hòa và cảm ứ ...