Giáo trình di truyền học part 9

Nếu dòng nào có chứa DNA mã hoá cho mRNA thì sẽ xảy ra hiện tượng lai giữa mRNA và vùng sợi đơn tương ứng trên DNA đó. Sau khi loại bỏ các mRNA không lai được, người ta đặt một miếng phim ảnh lên trên màng lọc; những vết ảnh xuất hiện trên ảnh phóng xạ tự ghi cho thấy vị trí của dòng mang DNA bổ trợ với mẫu RNA (Hình 8.9). Từ đây có thể tách riêng các dòng lai đặc hiệu để sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo. ...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Giáo trình di truyền học part 9 187ứng đã được tinh khiết và đánh dấu phóng xạ (P32); mẫu RNA này đượcgọi là vật dò phóng xạ (radioactive probe). Nếu dòng nào có chứa DNAmã hoá cho mRNA thì sẽ xảy ra hiện tượng lai giữa mRNA và vùng sợiđơn tương ứng trên DNA đó. Sau khi loại bỏ các mRNA không lai được,người ta đặt một miếng phim ảnh lên trên màng lọc; những vết ảnh xuấthiện trên ảnh phóng xạ tự ghi cho thấy vị trí của dòng mang DNA bổ trợvới mẫu RNA (Hình 8.9). Từ đây có thể tách riêng các dòng lai đặc hiệuđể sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo. Hình 8.10 minh họa các công đoạn của quy trình thí nghiệm DNA táitổ hợp ở vi khuẩn E. coli khi sử dụng môi trường nuôi cấy có bổ sungampicillin đối với ba kiểu tế bào: tế bào có mang plasmid tái tổ hợp, tế bàochỉ mang plasmid pUC19 không tái tổ hợp, và tế bào không biến nạp được(hình 8.10a). Qua đêm sinh trưởng, các tế bào nào có mang plasmid tái tổhợp và plasmid không tái tổ hợp sẽ mọc thành các khuẩn lạc (màu sắctương ứng ở đây là trắng và xanh; hình 8.10b). Sau khi chọn ra các dòngcó xen plasmid tái tổ hợp, đưa lên màng lọc và cho tiến hành lai hóa giữaRNA và DNA-gene của nó bằng các vật dò phóng xạ như đã nói ở trên.Sau đó đưa sản phẩm lai phân tử này lên tấm phim X quang để định vịgene quan tâm từ dòng tái tổ hợp (hình 8.10c). * Chọn lọc các tế bào truyền gene kháng với chất kháng sinh Vector plasmid chứa một genekháng ampicillin làm cho tế bào có tínhkháng. Tế bào được biến nạp Tế bào không biến nạp Sự sinh trưởng của các tế bàođược biến nạp (các tế bào tiếp nhận Môi trường dinh dưỡngplasmid) có thể được xác định trên môi +trường agar có chứa ampicillin chẳng X-galhạn. Hình 8.10a Sinh trưởng qua đêm Các dòng kháng ampicillin * Sự phát sinh đột biến xen đoạn cho phép xác định các plasmidmang DNA xen đoạn 188 Xác định các dòng Vector plasmid có chứagene có thể xác định được (ví Tế bào không Tế bào + pUC19 Tế bào + pUC19dụ, một khả năng kháng thuốc được biến nạp + đoạn xenthứ hai hoặc hoạt tính của Môi trường ddenzyme), với trình tự mã hoá +của gene này chứa vị trí giới ampicillinhạn cho xen đoạn. + Sự xen đoạn của DNA X-gal Sinh trưởng qua đêmngoại lai ở vị trí này làm giánđoạn kgung đọc mã của gene Các khuẩn lạc xanh: Các khuẩn lạc trắng: chỉ có pUC19 pUC19 + đoạn xenvà gây ra đột biến xen đoạn. Ở ví dụ này cho thấy, geneb-galactosidase bất hoạt. Cơchất X-gal đổi thành màu xanhnếu như gene không tiếp xúc, Các dòng kháng ampicillinnghĩa là làm cho enzyme cóhoạt tính. Các khuẩn lạc trắng ởX-gal chỉ ra sự có mặt của DNA Hình 8.10btái tổ hợp trong plasmid.5. Phát hiện và sàng lọc nucleic acid ngoại lai và protein Vật dò Tìm các dòng có chứa gene phóng xạ Màngphù hợp Trong sơ đồ này, các plasmidtái tổ hợp chứa trong vi khuẩnmọc được như là các khuẩn lạc.Các dòng là các blot được chuyểnsang một tấm màng lọc, và DNA Các dòng chọn lọccó mặt bị biến tính và được cố Lai hoáđịnỏctên bề mặt. Khi bổ sung vậtdò phóng xạ hay các đoạn bổsung và cho phép DNA lai hoá để Phim tia Xsau đó hiển lộ lênn phim X-quangcho phép xác định được dòng cóchứa DNA tái tổ hợp được ...